செய்தி

Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்).இதற்கிடையில், தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
புற்றுநோய் செல்கள் செல்லுலார் அழுத்தத்தை சமாளிக்க மற்றும் தொடர்ந்து முன்னேற பல்வேறு வழிமுறைகளை உருவாக்கியுள்ளன.புரோட்டீன் கைனேஸ் ஆர் (பிகேஆர்) மற்றும் அதன் புரோட்டீன் ஆக்டிவேட்டர் (பிஏசிடி) ஆகியவை செல் பெருக்கம் மற்றும் அப்போப்டொசிஸைத் தடுப்பதற்கு வழிவகுக்கும் பல்வேறு அழுத்த சமிக்ஞைகளைக் கண்காணிக்கும் ஆரம்ப பதிலளிப்பவர்கள்.இருப்பினும், புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் PACT-PKR பாதையின் கட்டுப்பாடு பெரும்பாலும் அறியப்படவில்லை.இங்கே, நீண்ட குறியீட்டு அல்லாத RNA (lncRNA) அஸ்பார்டில் tRNA சின்தேடேஸ் ஆன்டிசென்ஸ் RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR பாதையைத் தடுப்பதில் நேரடியாக ஈடுபட்டுள்ளது மற்றும் புற்றுநோய் உயிரணு பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது.CRISPRi 971 புற்றுநோயுடன் தொடர்புடைய lncRNA இன் பெரிய அளவிலான செயல்பாட்டுத் திரையிடலைப் பயன்படுத்தி, DARS-AS1 கணிசமாக மேம்படுத்தப்பட்ட புற்றுநோய் உயிரணு பெருக்கத்துடன் தொடர்புடையது என்பதைக் கண்டறிந்தோம்.எனவே, DARS-AS1 நாக் அவுட் செல் பெருக்கத்தைத் தடுக்கிறது மற்றும் விட்ரோவில் உள்ள பல்வேறு புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் புற்றுநோய் செல் அப்போப்டொசிஸை ஊக்குவிக்கிறது மற்றும் விவோவில் கட்டி வளர்ச்சியைக் கணிசமாகக் குறைக்கிறது.இயந்திர ரீதியாக, DARS-AS1 நேரடியாக PACT செயல்படுத்தும் களத்துடன் பிணைக்கிறது மற்றும் PACT-PKR தொடர்புகளைத் தடுக்கிறது, இதன் மூலம் PKR செயல்படுத்தல், eIF2α பாஸ்போரிலேஷன் மற்றும் அப்போப்டொடிக் செல் இறப்பைத் தடுக்கிறது.மருத்துவ ரீதியாக, DARS-AS1 பல புற்றுநோய்களில் பரவலாக வெளிப்படுத்தப்படுகிறது, மேலும் இந்த lncRNA இன் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு மோசமான முன்கணிப்பைக் குறிக்கிறது.இந்த ஆய்வு DARS-AS1 lncRNA மூலம் PACT-PKR பாதையின் புற்றுநோய்-குறிப்பிட்ட ஒழுங்குமுறையை தெளிவுபடுத்துகிறது மற்றும் புற்றுநோய் முன்கணிப்பு மற்றும் சிகிச்சைக்கான மற்றொரு இலக்கை வழங்குகிறது.
மன அழுத்தத்திற்கு ஏற்றவாறு செயல்படும் திறன் புற்றுநோய் உயிரணுக்களின் உயிர்வாழ்வு மற்றும் பெருக்கத்தின் ஒரு முக்கிய பண்பு ஆகும்.புற்றுநோயின் விரைவான பெருக்கம் மற்றும் வளர்சிதை மாற்ற அடையாளங்கள் கடுமையான நுண்ணுயிரிகளில் உச்சத்தை அடைகின்றன - ஊட்டச்சத்து குறைபாடு, ஹைபோக்ஸியா மற்றும் குறைந்த pH - இது உயிரணு இறப்பு சமிக்ஞை பாதைகளைத் தூண்டும்.p535, ஹீட் ஷாக் புரதங்கள் 6, 7, KRAS8, 9, மற்றும் HIF-110, 11, 12, 13 போன்ற மன அழுத்த உணர்திறன் மரபணுக்களின் ஒழுங்குபடுத்தல் புற்றுநோயில் அடிக்கடி கவனிக்கப்படுகிறது, இதனால் அப்போப்டொசிஸைத் தடுக்கிறது மற்றும் உயிர்வாழ்வதை ஊக்குவிக்கிறது.
புரோட்டீன் கைனேஸ் R (PKR) என்பது ஒரு முக்கியமான அழுத்த உணரி மற்றும் யூகாரியோடிக் துவக்க காரணி 2α (eIF2α) இன் துணைக்குழு கைனேஸ் ஆகும், இது செல்லுலார் அழுத்தத்தை உயிரணு இறப்புடன் இணைக்கும் மொழிபெயர்ப்பு சீராக்கி.பிகேஆர் முதலில் ஒரு ஆன்டிவைரல் புரதமாக அடையாளம் காணப்பட்டது, இதன் மூலம் ஒரு வெளிநாட்டு இரட்டை இழையுடைய ஆர்என்ஏ (டிஎஸ்ஆர்என்ஏ) கண்டறியப்பட்டது.செயல்படுத்தப்பட்டவுடன், பிகேஆர் பாஸ்போரிலேட்டுகள் eIF2α வைரஸ் மற்றும் செல்லுலார் புரதத் தொகுப்பைத் தடுக்கிறது14,15,16.DSRNA17,18,19,20,21,22,23 இல்லாத நிலையில் PACT (PKR Activator protein) முதல் PKR ஆக்டிவேட்டர் புரதமாக அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளது.PKR உடனான நேரடி தொடர்பு மூலம், PACT பல்வேறு அழுத்தங்களை (சீரம் பட்டினி, பெராக்சைடு அல்லது ஆர்சனைட் சிகிச்சை) PKR மற்றும் கீழ்நிலை சமிக்ஞை பாதைகளுக்கு கடத்துகிறது.eIF2α பாஸ்போரிலேஷனுடன் கூடுதலாக, PACT-மத்தியஸ்த PKR செயல்படுத்தல் மன அழுத்த பதிலுடன் தொடர்புடைய பல்வேறு நிகழ்வுகளைத் தூண்டுகிறது, PI3K/Akt24 பாதை வழியாக மாற்றப்பட்ட ரெடாக்ஸ் நிலை, p5325,26 மற்றும் NF-κB27,28 வழியாக மேம்படுத்தப்பட்ட டிஎன்ஏ சேத சோதனை மற்றும் 29 டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், 29 டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன். அழுத்த பதில், பெருக்கம், அப்போப்டொசிஸ் மற்றும் பிற முக்கிய செல்லுலார் செயல்முறைகளில் அவற்றின் முக்கிய பங்கைக் கருத்தில் கொண்டு, PKR மற்றும் PACT ஆகியவை பல நோய்களுக்கான சிகிச்சை இலக்குகளை உறுதியளிக்கின்றன, குறிப்பாக புற்றுநோய்30,31,32,33.இருப்பினும், இந்த பிளேயோட்ரோபிக் செயல்பாட்டு மற்றும் உயிரியல் முக்கியத்துவம் இருந்தபோதிலும், புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் PACT/PKR செயல்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துவது மழுப்பலாகவே உள்ளது.
எல்என்சிஆர்என்ஏக்கள் 200 நியூக்ளியோடைடுகளை விட பெரிய டிரான்ஸ்கிரிப்டுகள் ஆகும், அவை புரத-குறியீட்டு திறன் இல்லை.அதிநவீன முழு ஜீனோம் சீக்வென்சிங் திட்டங்கள் ஆயிரக்கணக்கான எல்என்சிஆர்என்ஏக்களை அடையாளம் கண்டுள்ளதால், அவற்றின் உயிரியல் செயல்பாடுகளை தெளிவுபடுத்துவதற்கு 35,36 அதிக முயற்சி எடுக்கப்பட்டுள்ளது.X-குரோமோசோம் செயலிழக்கத்தை ஒழுங்குபடுத்துதல்38,39, இம்ப்ரிண்டிங்40, டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன்41,42, மொழிபெயர்ப்பு43 மற்றும் புற்றுநோய் வளர்ச்சி44,45,46,47 உட்பட பல உயிரியல் செயல்முறைகளில் எல்என்சிஆர்என்ஏக்கள் ஈடுபட்டுள்ளன என்று வளர்ந்து வரும் ஆராய்ச்சிக் குழு காட்டுகிறது.இந்த ஆய்வுகள் பல lncRNAகள் PACT/PKR பாதையில் ஈடுபட்டுள்ளன என்று தெரிவித்தன.அத்தகைய ஒரு ஆய்வு, lncRNA ASPACT PACT டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைத் தடுக்கிறது மற்றும் PACT mRNA இன் அணுசக்தித் தக்கவைப்பை அதிகரித்தது.மற்ற ஆய்வுகள் lncRNA nc886 PKR உடன் பிணைக்கிறது மற்றும் அதன் பாஸ்போரிலேஷனைத் தடுக்கிறது49,50.இதுவரை, PACT-மத்தியஸ்த PKR செயல்படுத்தலை ஒழுங்குபடுத்தும் lncRNA அறிவிக்கப்படவில்லை.
அஸ்பார்டைல்-டிஆர்என்ஏ சின்தேடேஸ் ஆன்டிசென்ஸ் ஆர்என்ஏ 1 (டிஏஆர்எஸ்-ஏஎஸ்1) ஆன்கோஜெனிக் எல்என்சிஆர்என்ஏ51,52,53,54 என அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளது.miP-194-5p53, miP-12952 மற்றும் miP-532-3p51 ஆகியவற்றை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம், DARS-AS1 முறையே தெளிவான செல் சிறுநீரக செல் புற்றுநோய், தைராய்டு புற்றுநோய் மற்றும் சிறிய அல்லாத உயிரணு நுரையீரல் புற்றுநோயின் வளர்ச்சியை மேம்படுத்துவதாகக் காட்டப்பட்டுள்ளது.புரதம் 39 (RBM39) ஆர்என்ஏ-பிணைப்பு மையக்கருத்தின் நிலைத்தன்மையை பராமரிப்பதன் மூலம் DARS-AS1 மைலோமா முன்னேற்றத்தை ஊக்குவிக்கிறது என்பதையும் டோங் மற்றும் சக ஊழியர்கள் கண்டறிந்தனர்.இருப்பினும், இந்த lncRNA ஆனது PACT-PKR செயல்பாட்டின் ஒழுங்குமுறை மற்றும் புற்றுநோய் உயிரணுக்களின் அழுத்த பதிலில் ஈடுபட்டுள்ளதா என்பது குறித்து எந்த ஆய்வும் நடத்தப்படவில்லை.
இங்கே, CRISPRi அமைப்பைப் பயன்படுத்தி பெரிய அளவிலான செயல்பாட்டு இழப்புத் திரையைச் செய்தோம், மேலும் DARS-AS1 lncRNA பல வகையான புற்றுநோய் உயிரணுக்களின் பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது என்று தீர்மானித்தோம்.கூடுதலாக, நாங்கள் ஒரு முக்கிய பொறிமுறையை அடையாளம் கண்டுள்ளோம்: DARS-AS1 நேரடியாக PACT உடன் பிணைக்கிறது, PACT மற்றும் PKR பிணைப்பைத் தடுக்கிறது, eIF2α இன் பாஸ்போரிலேஷனைத் தடுக்கிறது, குறைந்த PKR அடி மூலக்கூறு, மற்றும் இறுதியில் அப்போப்டொடிக் செல் இறப்பைத் தடுக்கிறது.முடிவில், எங்கள் பணி DARS-AS1 lncRNA ஐ PACT-PKR பாதையின் சீராக்கி மற்றும் புற்றுநோய் சிகிச்சை மற்றும் முன்கணிப்புக்கான சாத்தியமான இலக்காக வெளிப்படுத்துகிறது.
விரிவான மரபணு விவரக்குறிப்பு ஆய்வுகள் புற்றுநோயுடன் தொடர்புடைய நூற்றுக்கணக்கான எல்என்சிஆர்என்ஏக்களை அடையாளம் கண்டுள்ளன.இருப்பினும், அவற்றின் செயல்பாடு பெரும்பாலும் அறியப்படவில்லை.புற்றுநோய் முன்னேற்றத்தில் ஈடுபட்டுள்ள நம்பிக்கைக்குரிய lncRNA வேட்பாளர்களை அடையாளம் காண, CRISPRi அமைப்பைப் பயன்படுத்தி SW620 பெருங்குடல் புற்றுநோய் உயிரணு வரிசையில் (படம் 1a) குறைக்கப்பட்ட பெருக்கத்திற்கான செயல்பாட்டு இழப்பு திரையை நாங்கள் செய்தோம்.SW480 மற்றும் SW620 பெருங்குடல் புற்றுநோய் செல் கோடுகளின் தனித்துவமான அம்சம் என்னவென்றால், அவை ஒரு நோயாளியின் முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை கட்டிகளிலிருந்து பெறப்படுகின்றன.மேம்பட்ட பெருங்குடல் புற்றுநோயின் வளர்ச்சியில் மரபணு மாற்றங்களைப் படிப்பதற்கான மதிப்புமிக்க ஒப்பீட்டை இது வழங்குகிறது.எனவே, RNA வரிசைமுறையைப் பயன்படுத்தி பெருங்குடல் புற்றுநோய் செல் கோடுகளின் (SW480 மற்றும் SW620) டிரான்ஸ்கிரிப்டோம்களை நாங்கள் பகுப்பாய்வு செய்தோம் மற்றும் வெளியிடப்பட்ட இலக்கியங்களிலிருந்து சில சாத்தியமான செயல்பாட்டு lncRNA களை சேகரித்தோம்.இந்த முடிவுகளின் அடிப்படையில், 971 புற்றுநோயுடன் தொடர்புடைய எல்என்சிஆர்என்ஏக்களை இலக்காகக் கொண்டு 7355 எஸ்ஜிஆர்என்ஏ ஒலிகோஸ் மற்றும் 500 இலக்கு இல்லாத எஸ்ஜிஆர்என்ஏ ஒலிகோக்களை எதிர்மறையான கட்டுப்பாட்டிற்காக (துணைத் தரவு 1) கொண்ட ஒரு பூல் செய்யப்பட்ட எஸ்ஜிஆர்என்ஏ நூலகத்தை வடிவமைத்தோம்.
CRISPRi அமைப்பைப் பயன்படுத்தி திரையிடலின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம்.b sgRNA செறிவூட்டல் திரையிடலுக்குப் பிறகு.கிடைமட்ட புள்ளியிடப்பட்ட கோடு log2 (மடிப்பு மாற்றம்) = ±0.58 ஐ குறிக்கிறது.செங்குத்து புள்ளியிடப்பட்ட கோடு p மதிப்பு = 0.05 ஐக் குறிக்கிறது.கருப்பு புள்ளிகள் இலக்கு அல்லாத sgRNA (NC என நியமிக்கப்பட்டது) குறிக்கிறது.சிவப்பு புள்ளிகள் DARS-AS1 ஐ குறிவைக்கும் sgRNA ஆகும்.நீலப் புள்ளிகள் LINC00205 ஐ இலக்காகக் கொண்ட sgRNA ஆகும், இது முன்பு விவரிக்கப்பட்ட ஆன்கோஜெனிக் lncRNA ஆகும்.மடிப்பு மாற்றம் = (இயல்பாக்கப்பட்ட வாசிப்பு, நாள் 17)/(இயல்பான வாசிப்பு, நாள் 0).c DARS-AS1 sgRNA நாக் டவுன் செல் வளர்ச்சியைத் தடுக்கிறது.பிழை பார்கள் மூன்று சோதனைகளின் ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.* ப ≤ 0.05, ** ப ≤ 0.01 இரு முனை மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்.d கட்டிகளில் DARS-AS1 வெளிப்பாடு (TCGA தரவுத்தொகுப்பு).முறையே BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP மற்றும் COAD நோயாளிகளிடமிருந்து இணைக்கப்பட்ட சாதாரண மற்றும் கட்டி மாதிரிகளில் DARS-AS1 இன் வெளிப்பாடு (TCGA தரவுத்தொகுப்பு).p-மதிப்புகள் இணைக்கப்பட்ட இரு வால் மாணவர்களின் t- சோதனையைப் பயன்படுத்தி பெறப்பட்டன.
பிளாஸ்மிட்டை உருவாக்கி, லென்டிவைரஸை பேக்கேஜிங் செய்த பிறகு, நான்கு சுயாதீன தொற்று சோதனைகளில் மேலே உள்ள நூலகத்துடன் dCas9-SW620 பெருங்குடல் புற்றுநோய் செல் வரிசையை கடத்தினோம்.இந்த நோய்த்தொற்றுகளுக்கான நோய்த்தொற்றின் பெருக்கம் (MOI) 0.1–0.3 ஆகும், இது ஒவ்வொரு செல்லையும் ஒரு sgRNA மூலம் மட்டுமே மாற்ற முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது.18 நாட்கள் இன் விட்ரோ கலாச்சாரத்திற்குப் பிறகு, ஸ்கிரீனிங்கிற்குப் பிறகு இலக்கு sgRNA களின் செறிவூட்டல் சுயவிவரம் குறைந்தது அல்லது அதிகரித்தது, அதே சமயம் இலக்கு அல்லாத கட்டுப்பாட்டு ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளின் எண்ணிக்கையானது ஸ்கிரீனிங்கிற்கு முந்தைய சுயவிவரத்துடன் ஒப்பிடும்போது ஒப்பீட்டளவில் மாறாமல் இருந்தது, இது எங்கள் இலக்கு அதிக திரை-குறிப்பிட்டது என்பதைக் குறிக்கிறது. நூலகம்.அரிசி.1b மற்றும் துணை அட்டவணை 1). LINC00205, நுரையீரல் புற்றுநோய் மற்றும் கல்லீரல் புற்றுநோய் முன்னேற்றத்தை ஊக்குவிக்கும் 58,59,60, திரையிடப்பட்டது (log2 (foldchange) < −0.58, p மதிப்பு <0.05), இந்தத் திரையிடலின் நம்பகத்தன்மையை உறுதிப்படுத்துகிறது (படம் 1b). LINC00205, நுரையீரல் புற்றுநோய் மற்றும் கல்லீரல் புற்றுநோய் முன்னேற்றத்தை ஊக்குவிக்கும் 58,59,60, திரையிடப்பட்டது (log2 (foldchange) < −0.58, p மதிப்பு <0.05), இந்தத் திரையிடலின் நம்பகத்தன்மையை உறுதிப்படுத்துகிறது (படம் 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, நுரையீரல் புற்றுநோய் மற்றும் கல்லீரல் புற்றுநோய்58,59,60 ஆகியவற்றின் முன்னேற்றத்தை ஊக்குவிப்பதாக முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டது (log2 (மடிப்பு மாற்றம்) <-0.58, p-மதிப்பு <0.05), இந்தத் திரையிடலின் வலிமையை உறுதிப்படுத்துகிறது (படம். 1b) . LINC00205 之前 被 报道 促进 促进 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（（（（） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 证实 该 筛选 （（（1B （1B （（（（（（ LINC00205 之前 被 报道 促进 促进 肺癌 和 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（（（（） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 证实 该 筛选 （（（1B （1B （（（（（（ LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, நுரையீரல் மற்றும் கல்லீரல் புற்றுநோய் முன்னேற்றத்தை ஊக்குவிப்பதாக முன்னர் அறிவிக்கப்பட்டது 58,59,60, விலக்கப்பட்டது (log2 (மடிப்பு மாற்றம்) <-0.58, p-மதிப்பு <0.05), இந்தத் திரையிடலின் வலிமையை உறுதிப்படுத்துகிறது (படம். 1b).
சோதனை செய்யப்பட்ட அனைத்து எல்என்சிஆர்என்ஏக்களிலும், டிஏஆர்எஸ்-ஏஎஸ்1 திரையிடப்பட்டது, 18 நாட்கள் கலாச்சாரத்திற்குப் பிறகு மூன்று காக்னேட் எஸ்ஜிஆர்என்ஏ ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகள் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டன, இந்த எல்என்சிஆர்என்ஏவின் நாக் டவுன் புற்றுநோய் பெருக்கத்தைக் குறைத்தது (படம். 1 பி).இந்த முடிவு பெருங்குடல் புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் MTS பகுப்பாய்வு மூலம் மேலும் ஆதரிக்கப்பட்டது, இது DARS-AS1 நாக் டவுன் செல்களின் வளர்ச்சி விகிதம் கட்டுப்பாட்டு செல்கள் (படம் 1 சி) உடன் ஒப்பிடும்போது பாதியாக மட்டுமே இருந்தது மற்றும் பல புற்றுநோய் வகைகளின் முந்தைய அறிக்கைகளுடன் ஒத்துப்போனது.: தெளிவான செல் சிறுநீரக புற்றுநோய், தைராய்டு புற்றுநோய் மற்றும் சிறிய அல்லாத செல் நுரையீரல் புற்றுநோய்51,52,53,55.இருப்பினும், பெருங்குடல் புற்றுநோயில் அதன் செயல்பாடு மற்றும் மூலக்கூறு வழிமுறைகள் ஆராயப்படாமல் உள்ளன.எனவே, மேலதிக ஆய்வுக்காக இந்த lncRNAயைத் தேர்ந்தெடுத்தோம்.
நோயாளிகளில் DARS-AS1 வெளிப்பாட்டைப் படிக்க, புற்றுநோய் ஜீனோம் அட்லஸ் (TCGA) திட்டத்தில் இருந்து 10,327 கட்டி மாதிரிகளை விரிவாக ஆய்வு செய்தோம்.பெருங்குடல் அடினோகார்சினோமா (COAD), சிறுநீரக தெளிவான செல் கார்சினோமா (KIRC) மற்றும் சிறுநீரக பாப்பில்லரி செல் கார்சினோமா (KIRP) உள்ளிட்ட பல்வேறு கட்டிகளில் உள்ள ஆரோக்கியமான உயிரணுக்களில் DARS-AS1 பரவலாக வெளிப்படுத்தப்பட்டுள்ளது மற்றும் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன..மிக சில (படம். 1d மற்றும் துணை படம் 1a, b). இணைக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான/கட்டி மாதிரிகளின் பகுப்பாய்வு, சிறுநீர்ப்பை யூரோதெலியல் கார்சினோமா (BLCA), சிறுநீரக சிறுநீரக தெளிவான செல் புற்றுநோய் (KIRC), புரோஸ்டேட் அடினோகார்சினோமா (PRAD), நுரையீரல் ஸ்கொமஸ் செல் கார்சினோமா (LUSC) ஆகியவற்றின் கட்டிகளில் DARS-AS1 இன் குறிப்பிடத்தக்க அதிக வெளிப்பாட்டை மேலும் உறுதிப்படுத்தியது. , கருப்பை கார்பஸ் எண்டோமெட்ரியல் கார்சினோமா (UCEC), நுரையீரல் அடினோகார்சினோமா (LUAD), கல்லீரல் ஹெபடோசெல்லுலர் கார்சினோமா (LIHC), சிறுநீரக சிறுநீரக பாப்பில்லரி செல் கார்சினோமா (KIRP), மற்றும் பெருங்குடல் அடினோகார்சினோமா (COAD) (p மதிப்பு <0.05) (படம். 1e-m) . இணைக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான/கட்டி மாதிரிகளின் பகுப்பாய்வு, சிறுநீர்ப்பை யூரோதெலியல் கார்சினோமா (BLCA), சிறுநீரக சிறுநீரக தெளிவான செல் புற்றுநோய் (KIRC), புரோஸ்டேட் அடினோகார்சினோமா (PRAD), நுரையீரல் ஸ்கொமஸ் செல் கார்சினோமா (LUSC) ஆகியவற்றின் கட்டிகளில் DARS-AS1 இன் குறிப்பிடத்தக்க அதிக வெளிப்பாட்டை மேலும் உறுதிப்படுத்தியது. , கருப்பை கார்பஸ் எண்டோமெட்ரியல் கார்சினோமா (UCEC), நுரையீரல் அடினோகார்சினோமா (LUAD), கல்லீரல் ஹெபடோசெல்லுலர் கார்சினோமா (LIHC), சிறுநீரக சிறுநீரக பாப்பில்லரி செல் கார்சினோமா (KIRP), மற்றும் பெருங்குடல் அடினோகார்சினோமா (COAD) (p மதிப்பு <0.05) (படம். 1e-m) .இணைக்கப்பட்ட ஆரோக்கியமான/கட்டி மாதிரிகளின் பகுப்பாய்வு, சிறுநீர்ப்பை யூரோடெலியல் கார்சினோமா (BLCA), தெளிவான செல் சிறுநீரக மற்றும் சிறுநீரக செல் புற்றுநோய் (KIRC), புரோஸ்டேட் அடினோகார்சினோமா (PRAD), நுரையீரல் ஸ்கொமஸ் செல் கார்சினோமா (LUSC) கட்டிகள் ஆகியவற்றில் DARS-AS1 இன் குறிப்பிடத்தக்க அதிக வெளிப்பாட்டை உறுதிப்படுத்தியது., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– மீ) . , கார்பஸ் கருப்பையின் எண்டோமெட்ரியல் கார்சினோமா (UCEC), நுரையீரலின் அடினோகார்சினோமா (LUAD), கல்லீரலின் ஹெபடோசெல்லுலர் கார்சினோமா (LIHC), சிறுநீரகத்தின் பாப்பில்லரி செல் கார்சினோமா (KIRP), மற்றும் பெருங்குடலின் அடினோகார்சினோமா (COAD) (p மதிப்பு < 0.05) (படம் 1e– மீ) ..显着 更 高 表达 ， 内膜 （（（ucec） ， （（（肝肝 （（lihc） ， 肾 （（（（கோட் （（P 值<0.05）（图1e-m） .配 对/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 了 尿路 皮癌 皮癌 、 肾 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 前列 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌.癌 (kirp）) (coad)ஆரோக்கியமான/கட்டி இணைக்கப்பட்ட மாதிரிகளின் பகுப்பாய்வு, சிறுநீர்ப்பை யூரோதெலியல் கார்சினோமா (BLCA), தெளிவான செல் சிறுநீரக செல் புற்றுநோய் (KIRC), புரோஸ்டேட் அடினோகார்சினோமா (PRAD) மற்றும் நுரையீரல் ஸ்கொமஸ் செல் கார்சினோமா (LUSC) கட்டிகளில் DARS-AS1 இன் பங்கை மேலும் ஆதரித்தது.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -மீ). கார்பஸ் கருப்பை புற்றுநோய் (UCEC), நுரையீரல் அடினோகார்சினோமா (LUAD), ஹெபடோசெல்லுலர் கார்சினோமா (LIHC), சிறுநீரக பாப்பில்லரி செல் கார்சினோமா (KIRP), மற்றும் பெருங்குடல் அடினோகார்சினோமா (COAD) (p மதிப்பு <0.05) (படம் 1e -m) ஆகியவற்றில் வெளிப்பாடு.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 பல்வேறு வகையான புற்றுநோய்களில் பரவலாகவும் அதிகமாகவும் வெளிப்படுத்தப்படுகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது.
DARS-AS1 மற்றும் DARS (ஆன்டிசென்ஸ் இழையை குறியாக்கம் செய்யும் மரபணு) ஒரே ஊக்குவிப்பாளரைப் பகிர்ந்துகொள்வதால், ஒன்றோடொன்று அமைந்திருப்பதால், DARS-ஐ குறிப்பாக நாக் டவுன் செய்ய shRNA ஐ வடிவமைத்தோம், ஆனால் DARS அல்ல (துணை படம். 2a,b மற்றும் துணை அட்டவணை 2 ) .SW620 ஐத் தவிர, shRNA நாக் டவுனின் (துணை அட்டவணை 3) செயல்திறன் மற்றும் செயல்பாட்டைப் படிக்க, DARS-AS1 ஐ அதிகமாக வெளிப்படுத்தும் மூன்று செல் கோடுகளையும் பயன்படுத்தினோம்.எங்கள் முடிவுகள் உருவாக்கப்பட்ட மூன்று shRNAகளும் DARS mRNA (துணை படம். 2c-f) அளவு மீது சிறிய விளைவைக் கொண்டு குறைந்தபட்சம் 80% DARS-AS1 நாக் டவுன் செயல்திறனை அடைந்துள்ளன என்று சுட்டிக்காட்டியது.கூடுதலாக, இந்த shRNAகளுடன் DARS-AS1 நாக் டவுன் SW620 (49.7%) மற்றும் HCT116 (27.7%), மார்பகப் புற்றுநோய் உயிரணு வரி MBA-MD-231 (53.4%) ஆகியவற்றில் உயிரணு வளர்ச்சியை கணிசமாகத் தடுக்கிறது என்பதைக் கண்டறிந்தோம்.) மற்றும் ஹெப்ஜி 2 ஹெபடோமா செல் கோடு (92.7% குறைப்பு), அத்துடன் இணைக்கப்படாத கோளங்களை உருவாக்கும் திறன் (சராசரி குறைப்பு ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% மற்றும் 75.7% செல் வரிக்கு) (படம். 2a,b).SW620 இல், காலனி உருவாக்க மதிப்பீட்டின் முடிவுகள், DARS-AS1 shRNA, சராசரியாக சுமார் 69.6% (படம். 2c) குறைந்து செல் பெருக்கத்தை கணிசமாகத் தடுக்கிறது என்பதை மேலும் உறுதிப்படுத்தியது.
SW620, HCT116, MBA-MD-231, மற்றும் HepG2 கலங்களில் செல் பெருக்கம் (a) மற்றும் ஸ்பீராய்டு உருவாக்கம் (b) மீது கட்டுப்பாட்டு shRNA மற்றும் DARS-AS1 shRNA ஆகியவற்றின் விளைவு.c SW620 கலங்களில் காலனி உருவாக்கத்தில் கட்டுப்பாடு shRNA மற்றும் DARS-AS1 shRNA ஆகியவற்றின் விளைவு.DARS-AS1 ஐ அதிகமாக வெளிப்படுத்தும் SW620 கலங்களின் செல் பெருக்கம் (d), கோள உருவாக்கம் (e), மற்றும் காலனி உருவாக்கம் (f).காட்டப்பட்ட தரவு மூன்று சோதனைகளின் சராசரி ± நிலையான விலகலாகும்.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, மற்றும் *** p ≤ 0.001 மூலம் இரு முனை மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்.
செயல்பாட்டு இழப்பு ஆய்வுகளை நிறைவு செய்ய, அடுத்ததாக DARS-AS1 (துணை படம் 2g) மிகைப்படுத்தி SW620 செல்களை உருவாக்கினோம்.DARS-AS1 அதிகப்படியான அழுத்தம் SW620 கலங்களில் (படம் 2d-f) செல் வளர்ச்சியை (1.8 மடங்கு), இணைக்கப்படாத கோள உருவாக்கம் (1.4 மடங்கு) மற்றும் காலனி உருவாக்கம் (3.3 மடங்கு) ஆகியவற்றை கணிசமாக அதிகரித்தது.மற்றொரு DARS-AS1 எக்ஸ்பிரஸ் செல் லைன், A549ஐப் பயன்படுத்தி இந்த முடிவை உறுதிசெய்தோம்.DARS-AS1 அதிகப்படியான வெளிப்பாடு காரணமாக இந்த மேம்படுத்தப்பட்ட செல் பெருக்கம் A549 கலங்களில் மேலும் காணப்பட்டது (துணை படம் 2h, i மற்றும் துணை அட்டவணை 3).ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த ஆதாயம் மற்றும் இழப்பு ஆய்வுகள் DARS-AS1 விட்ரோவில் புற்றுநோய் உயிரணு பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது என்பதை நிரூபிக்கிறது.
DARS-AS1 செல் பெருக்கத்தை ஒழுங்குபடுத்தும் அடிப்படை பொறிமுறையை ஆராய, அதன் சாத்தியமான புரத-பிணைப்பு கூட்டாளர்களை அடையாளம் காண ஆர்என்ஏ புல்-டவுன் பகுப்பாய்வு செய்தோம்.RT-qPCR முடிவுகள், DARS-AS1 இன் 86.2% SW620 கலங்களின் சைட்டோபிளாஸில் அமைந்துள்ளது (துணை படம். 3a).இன் விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்ட பயோடைனிலேட்டட் DARS-AS1 அல்லது சூடோஆர்என்ஏ பின்னர் SW620 செல் லைசேட்களுடன் அடைகாக்கப்பட்டு SDS-PAGE பிரிக்கப்பட்டது.DARS-AS1 இழுக்கும் மாதிரிகளில் ஒரு தனித்துவமான இசைக்குழு (~38 kDa) குறிப்பிடத்தக்க அளவில் செறிவூட்டப்பட்டிருக்கிறது, ஆனால் போலி RNA அல்லது மணிகள் மாதிரிகளில் (படம் 3a) இல்லை என்பதை அடுத்தடுத்த வெள்ளிக் கறை காட்டுகிறது.இந்த இசைக்குழு மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (MS) மூலம் PKR செயல்படுத்தும் புரதமாக (PACT) அடையாளம் காணப்பட்டது மற்றும் SW620, HCT116 மற்றும் HepG2 செல் கோடுகளில் (படம் 3a,b) இம்யூனோபிளாட்டிங் மூலம் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.DARS மற்றும் தொடர்புடைய PACT புரதங்களின் செறிவூட்டல் - PKR மற்றும் TRBP - வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டிங் (WB) மூலம் RNA பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி ஆராயப்பட்டது.DARS-AS1 RNA மற்றும் இந்த மூன்று புரதங்களுக்கிடையில் நேரடி தொடர்பு எதுவும் காணப்படவில்லை என்று முடிவுகள் சுட்டிக்காட்டின (துணை படம். 3b).DARS-AS1 மற்றும் PACT ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான குறிப்பிட்ட தொடர்பு ஆர்என்ஏ இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் (RIP) பகுப்பாய்வு மூலம் மேலும் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது, இது DARS-AS1 ஆனது PACT எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடிகளில் கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்டுள்ளது, ஆனால் மற்ற கட்டுப்பாட்டு RNAகள் அல்ல (படம் 3c).வேறு எந்த செல்லுலார் கூறுகளும் இல்லாத நிலையில் DARS-AS1 நேரடியாக PACT உடன் தொடர்பு கொள்கிறதா என்பதைத் தீர்மானிக்க, சுத்திகரிக்கப்பட்ட PACT ஐப் பயன்படுத்தி இன் விட்ரோ பயோலேயர் இன்டர்ஃபெரோமெட்ரி (BLI) மதிப்பீடு செய்யப்பட்டது.பயோட்டின்-லேபிளிடப்பட்ட DARS-AS1 அல்லது போலி ஆர்என்ஏ ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் (SA) பயோசென்சர்களில் அசையாது பின்னர் 1 μM PACT கொண்ட இயக்கத் தாங்கலில் அடைகாக்கப்பட்டது.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், PACT DARS-AS1 (KD மதிப்பு ~26.9 nM) உடன் வலுவாக பிணைக்கப்பட்டுள்ளது, ஆனால் RNA ஐப் பிரதிபலிக்கவில்லை (படம் 3d).ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 மற்றும் PACT க்கு இடையே ஒரு நேரடி தொடர்பு மற்றும் உயர் உறவை நிரூபிக்கின்றன.
ஆர்என்ஏ இழுக்கும் பகுப்பாய்வு DARS-AS1 SW620 கலங்களில் PACT உடன் தொடர்புகொள்வதை அடையாளம் கண்டுள்ளது.மேலே, தொடர்புடைய புரதங்களின் வெள்ளிக் கறை.குறைந்த இம்யூனோபிளாட்டுகள் PACT எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடி மூலம் செய்யப்பட்டன.b RNA புல்-டவுன் பகுப்பாய்வு HCT116 (மேல்) மற்றும் HepG2 (கீழ்) கலங்களில் செய்யப்பட்டது.இம்யூனோபிளாட்டிங் மூலம் PACT செறிவூட்டல் கண்டறியப்பட்டது.சுட்டிக்காட்டப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி SW620 கலங்களில் cRNA இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் (RIP) மதிப்பீடுகள் செய்யப்பட்டன.d PACT பைண்டிங் வளைவுகள் முழு நீள DARS-AS1 அல்லது கட்டுப்பாட்டு RNA க்கு உயிரி அடுக்கு இன்டர்ஃபெரோமெட்ரியை (BLI) பயன்படுத்தி பெறப்பட்டது.ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் பயோசென்சரில் ஆர்என்ஏ அசையாமல் இருந்தது.சங்கத்தை அளவிட 1 μM PACT பயன்படுத்தப்பட்டது.e RNA இழுத்தல் மதிப்பீடு பயோட்டினிலேட்டட் முழு-நீள DARS-AS1 அல்லது துண்டிக்கப்பட்ட (மேல்) பயன்படுத்தி செய்யப்பட்டது.PACT பெறப்பட்டதைக் காட்டும் இம்யூனோபிளாட் (கீழே).f சுத்திகரிக்கப்பட்ட கொடியிடப்பட்ட PACT ஆனது பயோடைனிலேட்டட் முழு-நீள DARS-AS1 உடன் அடைக்கப்பட்டது அல்லது இன் விட்ரோ RIP மதிப்பீட்டிற்காக துண்டிக்கப்பட்டது (e இல் உள்ளது போல).பிரித்தெடுக்கப்பட்ட RNA RT-qPCR ஆல் சரிபார்க்கப்பட்டது.பயோலேயர் இன்டர்ஃபெரோமெட்ரியைப் பயன்படுத்தி பிஏசிடிக்கான வெவ்வேறு ஆர்என்ஏ துண்டுகளின் ஒப்பீட்டுத் தொடர்பு பெறப்பட்டது.பகுப்பாய்விற்கு, 100 nM RNA மற்றும் 1 μM RAST ஆகியவை பயன்படுத்தப்பட்டன.h இன் விட்ரோ RIP மதிப்பீடுகள் சுத்திகரிக்கப்பட்ட அப்படியே அல்லது துண்டிக்கப்பட்ட PACT ஐப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டன.பிரித்தெடுக்கப்பட்ட RNA RT-qPCR ஆல் சரிபார்க்கப்பட்டது.i DARS-AS1, PACT அல்லது இரண்டையும் அதிகமாக வெளிப்படுத்தும் SW620 கலங்களின் வளர்ச்சி விகிதம்.j SW620 கலங்களில் முழு நீளம் அல்லது துண்டிக்கப்பட்ட DARS-AS1 இன் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு செல் வளர்ச்சியில் வெவ்வேறு விளைவுகளை ஏற்படுத்தியது.k அப்போப்டொசிஸ் PARP எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடி மூலம் இம்யூனோபிளாட்டிங் மூலம் கண்டறியப்பட்டது.l DARS-AS1 இன் நாக் அவுட், ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி மூலம் காட்டப்பட்டுள்ளபடி SW620 கலங்களின் அப்போப்டொசிஸைத் தூண்டுகிறது.காட்டப்பட்ட தரவு மூன்று சோதனைகளின் சராசரி ± நிலையான விலகலாகும். *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, இரு முனை மாணவர்களின் t சோதனை மூலம். *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, இரு முனை மாணவர்களின் t சோதனை மூலம். ப *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 by two-tailed Student's t-test. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验。 ப *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 by two-tailed Student's t-test.
PACT சங்கத்திற்குத் தேவையான DARS-AS1 பகுதியைக் கண்டறிய விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் மூலம் மூன்று பயோட்டினிலேட்டட் DARS-AS1 RNA துண்டுகளை உருவாக்கினோம் (படம் 3e).ஆர்.என்.ஏ பகுப்பாய்வு முடிவுகள் ஒவ்வொரு துண்டையும் PACT உடன் தொடர்பு கொள்ள முடியும் என்பதைக் காட்டியது, ஆனால் 3′-முனையப் பகுதி (384-768 நியூக்ளியோடைடுகள் A3 என்று பெயரிடப்பட்டது) 1-384 நியூக்ளியோடைட்களை A1 என்று லேபிளிடப்பட்டது (படம். 3e).மறுசீரமைப்பு PACT (படம் 3f) ஐப் பயன்படுத்தி இன் விட்ரோ RIP மதிப்பீட்டில் இதே போன்ற முடிவுகள் காணப்பட்டன.இந்த முடிவுகளுக்கு இணங்க, BLI ஐப் பயன்படுத்தி அசையாத RNA துண்டுகளை PACT உடன் பிணைப்பதற்கான சோதனைகள், PACT ஆனது A3 (384–768 nt) (KD மதிப்பு தோராயமாக 94.6 nM) உடன் அதிக ஈடுபாட்டைக் கொண்டிருப்பதைக் காட்டியது, அதே நேரத்தில் மற்ற பகுதிகளுடன் கிட்டத்தட்ட எந்த தொடர்பும் இல்லை.(படம் 3d).
PACT இல் தொடர்புடைய பிணைப்பு பகுதிகளையும் நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம்.PACT மூன்று செயல்பாட்டுக் களங்களைக் கொண்டுள்ளது, அவற்றில் இரண்டு பாதுகாக்கப்பட்ட இரட்டை இழைகள் கொண்ட ஆர்என்ஏ-பைண்டிங் டொமைன்கள் (dsRBD) மற்றும் மூன்றாவது டொமைன் (நியமிக்கப்பட்ட D3) புரத தொடர்புகளை செயல்படுத்துகிறது.ஒவ்வொரு டொமைனின் எல்என்சிஆர்என்ஏ பிணைப்பு திறனை ஆய்வு செய்ய, நாங்கள் மூன்று பிறழ்வுகளை வடிவமைத்தோம், அவை மூன்று டொமைன்களில் ஒவ்வொன்றையும் அகற்றி, இன் விட்ரோ ஆர்ஐபி மதிப்பீட்டைச் செய்தோம்.மற்ற இரண்டு பிறழ்வுகளுடன் (படம் 3h) ஒப்பிடும்போது, ​​PACT இன் மூன்றாவது டொமைனை (D3) நீக்குவது DARS-AS1 உடனான அதன் தொடர்பைக் கணிசமாகக் குறைத்தது (அப்படியே PACT உடன் ஒப்பிடும்போது 0.11 மடங்கு) என்று எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன. D3 DARS உடன் தொடர்பு கொண்டது.-ஏசி1.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 மற்றும் PACT ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு முதன்மையாக DARS-AS1 இன் 3′ முடிவு மற்றும் PACT இன் D3 டொமைன் மூலம் நிகழலாம் என்று கூறுகின்றன.
PACT வெளிப்பாட்டில் DARS-AS1 எந்த விளைவையும் ஏற்படுத்தவில்லை என்பதையும், PACT ஆனது DARS-AS1 இல் எந்த விளைவையும் ஏற்படுத்தவில்லை என்பதையும் நாங்கள் குறிப்பிட்டோம் (துணை படம். 3c).செல் வளர்ச்சியில் PACT நாக் டவுனின் விளைவை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம்.DARS-AS1 க்கு மாறாக, PACT வீழ்த்தப்பட்டபோது உறவினர் செல்கள் 1.5-3 மடங்கு வேகமாக வளர்ந்தன (துணை படம். 3d).PACT (துணை படம் 3e) உடன் shRNA சிகிச்சைக்குப் பிறகு செல்கள் 2-3 மடங்கு காலனிகளை உருவாக்கியது என்று காலனி உருவாக்க மதிப்பீட்டின் முடிவுகள் சுட்டிக்காட்டுகின்றன.PACT மூலம் செல் பெருக்கத்தை DARS-AS1 கட்டுப்படுத்துகிறதா என்பதைச் சோதிக்க, PACT, DARS-AS1 அல்லது இரண்டையும் மிகைப்படுத்தி SW620 செல்களை உருவாக்கினோம்.PACT இன் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு செல் பெருக்கத்தின் குறிப்பிடத்தக்க தடுப்பைக் காட்டியது (படம் 3i).DARS-AS1 அதிகப்படியான வெளிப்பாடு செல் பெருக்கத்தை கணிசமாக ஊக்குவித்தாலும், DARS-AS1 மற்றும் PACT ஐ அதிகமாக வெளிப்படுத்தும் செல்களின் வளர்ச்சி விகிதத்தில் குறிப்பிடத்தக்க வேறுபாடு இல்லை.இந்த முடிவுகள் PACT ஆனது DARS-AS1 அதிகப்படியான அழுத்தத்தால் ஏற்படும் அதிகரித்த பெருக்கத்தை எதிர்க்கக்கூடும் என்று தெரிவிக்கிறது.
DARS-AS1 இன் வெவ்வேறு பகுதிகள் வெவ்வேறு PACT-பிணைப்பு திறன்களைக் கொண்டிருப்பதால், DARS-AS1 துண்டுகளின் வெவ்வேறு அதிகப்படியான வெளிப்பாடு மூலம் செல் பெருக்கத்தில் அவற்றின் ஒப்பீட்டு செல்வாக்கை ஆராய்ந்தோம்.மற்ற இரண்டு துண்டுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, ​​DARS-AS1 3′ இறுதியில் (384–768 nt) மிகையாக அழுத்தப்பட்டது, இது DARS-AS1 இல் உள்ள முக்கிய PACT தொடர்பான பகுதி, இது செல் பெருக்கத்தைத் தூண்டும் மிக உயர்ந்த திறனைக் கொண்டிருந்தது (படம் 3j).இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 இன் பிணைப்பு திறன் மற்றும் உயிரியல் செயல்பாடு ஆகியவற்றுக்கு இடையே ஒரு நேர்மறையான தொடர்பைக் குறிக்கிறது.
PACT ஆனது அப்போப்டொடிக் புரோட்டீன்19 என்று தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது.எனவே, அப்போப்டொசிஸில் DARS-AS1 இன் விளைவை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம்.எதிர்பார்த்தபடி, DARS-AS1 நாக் டவுன் SW620 கலங்களில் PARP பிளவுகளை கணிசமாக அதிகரித்தது மற்றும் SW620, HCT116, HepG2 மற்றும் MBA-MD-231 செல் கோடுகள் (படம் 3k) ஆகியவற்றில் அனெக்சின் V-பாசிட்டிவ் செல்களின் விகிதத்தை அதிகரித்தது.3)3f-h), புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் DARS-AS1 இன் அபோப்டோடிக் எதிர்ப்பு விளைவு PACT இன் அப்போப்டொசிஸ்-தூண்டுதல் செயல்பாட்டிற்கு நேர்மாறானது என்பதைக் குறிக்கிறது.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், DARS-AS1 ஆன்கோஜெனிக் செயல்பாட்டின் பொறிமுறையானது PACT செயல்பாட்டைத் தடுப்பதன் மூலம் இருக்கலாம் என்று இந்த முடிவுகள் தெரிவிக்கின்றன.
அடுத்து, DARS-AS1-PACT சங்கத்தின் செயல்பாட்டு தாக்கங்களை ஆராய்ந்தோம்.PACT ஆனது PKR ஐ நேரடி தொடர்பு மூலம் செயல்படுத்துவதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது, இது பின்னர் eIF2α பாஸ்போரிலேஷனை மேம்படுத்துகிறது, இதனால் மொழிபெயர்ப்பு நீக்கம் மற்றும் அப்போப்டொசிஸ்17.முதலில், PACT மற்றும் PKR இன் செல்லுலார் உள்ளூர்மயமாக்கலை DARS-AS1 பாதிக்கிறதா என்பதை நாங்கள் ஆய்வு செய்தோம்.0.72 சராசரி பியர்சன் தொடர்பு குணகம் கொண்ட SW620 கலங்களில் PACT மற்றும் PKR ஆகியவை அதிக அளவில் இணைந்திருப்பதை கன்ஃபோகல் ஃப்ளோரசன்ஸ் மைக்ரோஸ்கோபி காட்டுகிறது.இதற்கிடையில், DARS-AS1 அதிகப்படியான வெளிப்பாடு PACT மற்றும் PKR இணை-உள்ளூர்மயமாக்கலைக் கணிசமாகக் குறைத்தது (அதாவது பியர்சன் தொடர்பு குணகம் 0.61) (படம் 4a).DARS-AS1 ஆனது PACT-PKR தொடர்புகளை மாற்றியமைக்க முடியுமா என்பதை ஆராய, SW620 செல் லைசேட்டுகளில் PACT எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடியுடன் இணை-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் (co-IP) மதிப்பீட்டை நாங்கள் செய்தோம்.கட்டுப்பாட்டு கலங்களில் PKR எதிர்ப்பு PACT இல் செறிவூட்டப்பட்டது, அதே சமயம் DARS-AS1 (படம் 4b) ஐ மிகையாக அழுத்தும் செல்களிலிருந்து லைசேட்களில் PKR மீட்பு கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது.சுத்திகரிக்கப்பட்ட லேபிளிடப்பட்ட PACT மற்றும் PKR ஆகியவை விட்ரோ புரத பிணைப்பு மதிப்பீடுகளுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன.அதன்படி, DARS-AS1 ஐ வழங்கியது ஆனால் எந்த கட்டுப்பாட்டு RNAயும் அடக்கப்பட்ட PACT-PKR தொடர்புகளைக் காட்டவில்லை (படம் 4c).அனைத்து முடிவுகளும் DARS-AS1 PACT மற்றும் PKR தகவல்தொடர்புகளை சீர்குலைத்தது என்பதைக் காட்டுகிறது.
கட்டுப்பாட்டு செல்கள் அல்லது DARS-AS1 ஐ அதிகமாக அழுத்தும் செல்களில் PACT மற்றும் PKR இன் இணை-உள்ளூர்மயமாக்கல் கன்ஃபோகல் ஃப்ளோரசன்ஸ் மைக்ரோஸ்கோபியைப் பயன்படுத்தி காணப்பட்டது.கருக்கள் DAPI உடன் படிந்திருந்தன.16 புகைப்படங்களிலிருந்து புள்ளிவிவர முடிவுகள் பெறப்பட்டன.b Co-immunoprecipitation (co-IP) SW620 கட்டுப்பாட்டு செல்கள் அல்லது DARS-AS1 ஐ அதிகமாக வெளிப்படுத்தும் செல்களில் PACT எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்துகிறது.c லேபிளிடப்பட்ட PACT, சுத்திகரிக்கப்பட்ட PKR மற்றும் DARS-AS1 அல்லது mock RNA உடன் விட்ரோவில் டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்டவை இன் விட்ரோ புரோட்டீன் பைண்டிங் பகுப்பாய்விற்காக அடைக்கப்பட்டுள்ளன.கொடி எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடிகள் நோயெதிர்ப்பு தடுப்புக்கு பயன்படுத்தப்பட்டன.d சுட்டிக்காட்டப்பட்ட ஆன்டிபாடிகள் கொண்ட இம்யூனோபிளாட்டுகள் SW620 மற்றும் HCT116 செல்கள் கட்டுப்பாட்டு shRNA அல்லது DARS-AS1-shRNA உடன் மாற்றப்பட்டு சீரம் பட்டினியால் செய்யப்பட்டன.e DARS-AS1 வெளிப்பாடு நிலைகள் டாப்சிகார்ஜினுக்கான செல்லுலார் உணர்திறனை மாற்றியது.SW620 செல்கள் DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ஓவர் எக்ஸ்பிரஷன் பிளாஸ்மிட் அல்லது கண்ட்ரோல் பிளாஸ்மிட் மூலம் மாற்றப்பட்டன.செல்கள் டாப்சிகார்ஜினுடன் 48 மணிநேரம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டு, எம்டிஎஸ் மறுஉருவாக்கத்தைப் பயன்படுத்தி செல் நம்பகத்தன்மை தீர்மானிக்கப்பட்டது.f இன் விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ட் செய்யப்பட்ட DARS-AS1 அல்லது போலி ஆர்என்ஏ மற்றும் சுத்திகரிக்கப்பட்ட PACT ஆகியவை விட்ரோ ஆக்டிவேஷன் மதிப்பீடு மற்றும் இம்யூனோபிளாட் கண்டறிதலுக்குப் பயன்படுத்தப்பட்டன.g இந்த ஆன்டிபாடிகளைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோபிளாட்டுகள் SW620-ctrl செல்கள் (இடது) அல்லது PKR மரபுபிறழ்ந்தவர்களை (வலது) அதிகமாக அழுத்தும் செல்களில் நிகழ்த்தப்பட்டன.இந்த செல்கள் பின்னர் கட்டுப்பாட்டு shRNA அல்லது DARS-AS1-shRNA மூலம் சீரம் பட்டினியால் மாற்றப்பட்டன.h ஃப்ளோ சைட்டோமெட்ரி, பிறழ்ந்த PKR செயலிழக்கச் செய்வது, SW620 கலங்களில் DARS-AS1-தூண்டப்பட்ட அப்போப்டொசிஸுக்கு ஈடுகொடுக்கிறது என்பதைக் காட்டுகிறது.சுட்டிக்காட்டப்பட்ட ஆன்டிபாடிகளுடன் கூடிய இம்யூனோபிளாட்டுகள் SW620 (இடது) அல்லது HCT116 (வலது) கலங்களில் செய்யப்பட்டன.கட்டுப்பாட்டு shRNA அல்லது DARS-AS1 shRNA உடன் மாற்றப்பட்ட செல்கள் சீரம் இல்லாதவை மற்றும் 100 nM PKR C16 இன்ஹிபிட்டர் அல்லது DMSO உடன் கூடுதலாக வழங்கப்படுகின்றன.அளவுகோல் = 5 µm.காட்டப்பட்ட தரவு மூன்று சோதனைகளின் சராசரி ± நிலையான விலகலாகும்.* ப ≤ 0.05 இரு முனை மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்.
PACT PKR17 உடன் தொடர்பு கொண்டவுடன், Thr451 இல் PKR பாஸ்போரிலேஷன் தூண்டப்படலாம் என்று பொதுவாக நம்பப்படுகிறது.சீரம் பட்டினிக்குப் பிறகு DARS-AS1 நாக் டவுன் செல்களில் PKR பாஸ்போரிலேஷன் அளவு கணிசமாக உயர்த்தப்பட்டதை எங்கள் முடிவுகள் சுட்டிக்காட்டின (படம் 4d மற்றும் துணைப் படம் 4a).அதன்படி, முக்கிய PKR அடி மூலக்கூறான eIF2α இன் பாஸ்போரிலேஷன் DARS-AS1 shRNA ஆல் கணிசமாக அதிகரிக்கப்பட்டதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 4d மற்றும் துணைப் படம் 4a).தப்சிகார்ஜின் என்பது ER அழுத்தமானியாகும், இது ER ஆனது Ca2+ ஐ வெளியிடுகிறது.டாப்சிகார்ஜினுடனான சிகிச்சையானது PACT இன் வெளிப்பாடு மற்றும் செயல்படுத்தலைத் தூண்டுவதாக அறிவிக்கப்பட்டுள்ளது, இது PKR உடன் மேலும் தொடர்புகொண்டு செயல்படுத்துகிறது, eIF2α பாஸ்போரிலேஷன் 18,61 ஐ அதிகரிப்பதன் மூலம் அப்போப்டொசிஸுக்கு வழிவகுக்கிறது.இங்கே, PACT/PKR பாதையைத் தடுப்பதன் மூலம் செல்கள் அழுத்தத்தைக் கடக்க DARS-AS1 உதவுமா என்பதை ஆராய்வதற்காக, PACT/PKR பாதையின் தூண்டுதலாக டாப்சிகார்ஜினைப் பயன்படுத்தினோம்.DARS-AS1 வெளிப்பாட்டின் நிலை டாப்சிகார்ஜினுக்கான செல் எதிர்ப்போடு நேர்மறையாக தொடர்புடையது என்பதை நாங்கள் கவனித்தோம்.DARS-AS1 ஐ மிகையாக வெளிப்படுத்தும் SW620 செல்கள் டாப்சிகார்ஜினுடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டபோது சிறப்பாக உயிர் பிழைத்தன, அதே சமயம் DARS-AS1 நாக் டவுன் கொண்ட செல்கள் மிகவும் எளிதில் பாதிக்கப்படும் (படம் 4e).இந்த முடிவுகளுக்கு இணங்க, DARS-AS1 அதிகப்படியான அழுத்தம் டாப்சிகார்ஜின்-தூண்டப்பட்ட PKR பாஸ்போரிலேஷனைக் குறைத்தது (துணை படம். 4b).இதற்கு நேர்மாறாக, டாப்சிகார்ஜின் சிகிச்சைக்குப் பிறகு, கட்டுப்பாட்டுக் கலங்களுடன் ஒப்பிடும்போது DARS-AS1 நாக் டவுன் கலங்களில் PKR மற்றும் eIF2α அதிக அளவில் பாஸ்போரிலேட் செய்யப்பட்டன (துணை படம். 4b).சுவாரஸ்யமாக, டாப்சிகார்ஜின் DARS-AS1 வெளிப்பாட்டை டோஸ்-சார்பு முறையில் தூண்டியது, இது DARS-AS1 இன் அழுத்த எதிர்ப்பு செயல்பாட்டைக் குறிக்கலாம் (துணை படம். 4c).கூடுதலாக, இந்த அவதானிப்புகளை உறுதிப்படுத்த விட்ரோ ஆக்டிவேஷன் மதிப்பீடுகளை நாங்கள் செய்தோம்.சுருக்கமாக, PKR ஆனது PKR எதிர்ப்பு ஆன்டிபாடியைப் பயன்படுத்தி செல் லைசேட்டுகளிலிருந்து சுத்திகரிக்கப்பட்டது, பின்னர் மறுசீரமைப்பு PACT மற்றும் DARS-AS1 உடன் விட்ரோவில் படியெடுக்கப்பட்டது.நொதி எதிர்வினைக்குப் பிறகு, WB ஐப் பயன்படுத்தி பாஸ்போ-பிகேஆர் கண்டறியப்பட்டது.எங்கள் முடிவுகள் பிகேஆர் பாஸ்போரிலேஷன் DARS-AS1 ஆல் கணிசமாக தடுக்கப்பட்டது, ஆனால் கட்டுப்பாட்டு RNA மூலம் தடுக்கப்படவில்லை (படம் 4f).இந்த இன் விட்ரோ மற்றும் இன் விவோ முடிவுகள் DARS-AS1 PACT-மத்தியஸ்த PKR செயல்பாட்டைத் தடுக்கிறது என்று கூறுகின்றன.அதே நேரத்தில், DARS-AS1 (படம் 4f) முன்னிலையில் PACT மீட்பு குறைவதையும் நாங்கள் கவனித்தோம்.இந்த முடிவு இன் விட்ரோ புரத பிணைப்பு மதிப்பீட்டின் முடிவுகளுடன் ஒத்துப்போகிறது (படம் 4c) மேலும் PACT-PKR சங்கத்திற்கான DARS-AS1 இன் தடுப்பு செயல்பாட்டை மீண்டும் விளக்குகிறது.
செல்லுலார் அழுத்தத்தின் கீழ் PKR செயல்படுத்துவதற்கு PACT இன் D3 டொமைனில் Ser246 மற்றும் Ser287 தேவை.அலனைனுக்கு இரண்டு செரின் எச்சங்களை மாற்றுவது விகாரமான PACT (mutD) ஐ அளித்தது, இது அழுத்தம் இல்லாத நிலையில் PKR ஐ செயல்படுத்தியது, மேலும் அலனைனுக்கு (mutA) மாற்றீடு நெறிமுறையை மாற்றியது.DARS-AS1 உடன் நேரடியாக இணைந்து இந்த டொமைனின் முக்கியத்துவத்தை நாங்கள் நிரூபித்ததால், இந்த எச்சங்கள் DARS-AS1 உடனான தொடர்புகளில் ஈடுபட முடியுமா என்பதை சோதிக்க இந்த இரண்டு PACT மரபுபிறழ்ந்தவர்களை உருவாக்கினோம்.சுவாரஸ்யமாக, இரு மரபுபிறழ்ந்தவர்களும் DARS-AS1 உடன் பிணைக்கும் திறனை இழந்தனர் (துணை படம். 4d), DARS-AS1 உடனான திறமையான தொடர்புக்கு PACT புரதத்தின் முழுமையான அமைப்பு தேவைப்படலாம் என்று பரிந்துரைக்கிறது.
மேலும், DARS-AS1-shRNA தூண்டப்பட்ட செல் பெருக்கத் தடுப்பை ஒரு மேலாதிக்க எதிர்மறை PACT விகாரி (PACTmutA) அல்லது ஆதிக்கம் செலுத்தும் எதிர்மறை PKR விகாரி (PKRmut) (துணை படம் 4e. e) மிகைப்படுத்துவதன் மூலம் ஓரளவு மீட்டெடுக்க முடியும் என்றும் எங்கள் முடிவுகள் தெரிவிக்கின்றன.ஆதிக்கம் செலுத்தும்-எதிர்மறை PKR மரபுபிறழ்ந்தவர்களின் அதிகப்படியான வெளிப்பாடு DARS-AS1 நாக் டவுன் மூலம் தூண்டப்பட்ட PKR பாஸ்போரிலேஷன் மற்றும் சீரம்-இழந்த செல்களில் eIF2α பாஸ்போரிலேஷனைக் குறைத்தது (படம். 4g).மிக முக்கியமாக, DARS-AS1 நாக் டவுன் மூலம் தூண்டப்பட்ட அப்போப்டொடிக் செல்களின் விகிதம் PKRmut (படம். 4h மற்றும் துணைப் படம். 4g) அதிகமாக அழுத்தும் கலங்களில் குறைக்கப்பட்டது.PKR கைனேஸ் செயல்பாட்டின் தடுப்பு DARS-AS1 செயல்பாட்டையும் பாதிக்கிறது, ஏனெனில் DARS-AS1 நாக் டவுன் PKR மற்றும் eIF2α பாஸ்போரிலேஷனை அரிதாகவே தூண்டுகிறது என்று செல்கள் PKR-குறிப்பிட்ட C16 இன்ஹிபிட்டருடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டபோது (படம். 4i மற்றும் துணை படம். 4h).)ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், PACT-மத்தியஸ்த PKR செயல்பாட்டைத் தடுப்பதன் மூலம் DARS-AS1 செல் பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது என்று எங்கள் முடிவுகள் தெரிவிக்கின்றன.
டூமோரிஜெனெசிஸில் DARS-AS1 இன் பங்கை மேலும் ஆராய, மவுஸ் சினோகிராஃப்ட் மாதிரியைப் பயன்படுத்தி விவோ சோதனைகளில் நாங்கள் செய்தோம். DARS-AS1 இன் நாக் டவுன் எலிகளில் கட்டி வளர்ச்சியை வெகுவாகக் குறைத்ததாக முடிவுகள் காட்டுகின்றன (p மதிப்பு <0.0001) (படம் 5a). DARS-AS1 இன் நாக் டவுன் எலிகளில் கட்டி வளர்ச்சியை வெகுவாகக் குறைத்ததாக முடிவுகள் காட்டுகின்றன (p மதிப்பு <0.0001) (படம் 5a). ரெஸுல்டட் போகாஸிவூட்டு, CHTO NOKDAUN DARS-AS1 ரெஸ்கோ ஸ்னிஜேத் ரோஸ்ட் ஓபுஹோலி யு மைஷே (பதில் <0,0001) DARS-AS1 நாக் டவுன் எலிகளில் கட்டி வளர்ச்சியை வெகுவாகக் குறைக்கிறது (p மதிப்பு <0.0001) (படம் 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）））图5a结果 表明 ， dars-as1 的 敲低 显着 降低 了 （（（（<0.0001 （（5a） ரெஸுல்டட் போகசலி, CHTO NOKDAUN DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (நாட்செனி 10,000). DARS-AS1 நாக் டவுன் எலிகளில் கட்டி வளர்ச்சியைக் கணிசமாகக் குறைத்தது (p மதிப்பு <0.0001) (படம் 5a).எனவே, DARS-AS1 நாக் டவுன் குழுவில், சராசரி கட்டியின் அளவு சுமார் 72.9% ஆகவும், கட்டியின் நிறை சராசரியாக 87.8% ஆகவும் கணிசமாகக் குறைந்துள்ளது (படம் 5b-d).இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 விவோவில் கட்டி வளர்ச்சியை கணிசமாக ஊக்குவிக்கும் என்று உறுதியாகக் கூறுகின்றன.
நிர்வாண எலிகளில் பெருங்குடல் புற்றுநோயின் மீதான விளம்பர DARS-AS1 நாக் டவுனின் விளைவுகள்.வளர்ச்சி வளைவுகள் (a), கட்டி அளவு (b), எடை (c) மற்றும் கட்டி படங்கள் (d) காட்டப்பட்டுள்ளன.பிழை பார்கள் ± SEM ஐக் குறிக்கின்றன. n = 10. ****p <0.0001, இரு முனை மாணவர்களின் t சோதனை மூலம். n = 10. ****p <0.0001, இரு முனை மாணவர்களின் t சோதனை மூலம். n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 இரு முனை மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்.n = 10. ****p <0.0001,通过双尾学生t 检验。 ****p <0.0001,通过双尾学生t检验。 ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 இரு முனை மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்.e Kaplan-Meier DARS-AS1 வெளிப்பாடு நிலைகளுக்கும் UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM மற்றும் LGG நோயாளிகளின் ஒட்டுமொத்த உயிர்வாழ்விற்கும் இடையே உள்ள தொடர்பை ஆய்வு செய்தார்.நோயாளிகளில் DARS-AS1 வெளிப்பாட்டின் உயர் நிலைகள் முதல் 50% இல் இருந்தன;நோயாளிகளின் குறைந்த அளவு DARS-AS1 வெளிப்பாடு கீழே 50% இல் இருந்தது.பதிவு தரவரிசை சோதனையைப் பயன்படுத்தி p- மதிப்புகள் தீர்மானிக்கப்பட்டது.f முன்மொழியப்பட்ட மாதிரி, இதில் DARS-AS1 PACT-PKR பாதை மற்றும் கட்டி வளர்ச்சியை ஒழுங்குபடுத்துகிறது.
DARS-AS1 இன் மருத்துவ தாக்கத்தை நன்கு புரிந்து கொள்ள, அதன் வெளிப்பாட்டிற்கும் நோயாளியின் உயிர்வாழ்விற்கும் உள்ள தொடர்பை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம்.TCGA தரவுத்தொகுப்பை பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம், அதிக DARS-AS1 வெளிப்பாடு யுவல் மெலனோமா (UVM), சிறுநீரக குரோமோபோபியா (KICH), சிறுநீரக பாப்பில்லரி செல் கார்சினோமா (KIRP), மீசோதெலியோமா (MESO), மல்டிபிளக்ஸ் ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடையது என்பதைக் கண்டறிந்தோம்.குறைந்த உயிர்வாழ்வு கிளியோபிளாஸ்டோமா மார்போசிஸ் (ஜிபிஎம்) மற்றும் குறைந்த தர மூளை க்ளியோமா (எல்ஜிஜி) நோயாளிகளுடன் கணிசமாக தொடர்புடையது (படம் 5 ஈ).இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 மருத்துவக் கட்டி முன்னேற்றத்தில் முக்கியப் பங்கு வகிக்கலாம் மற்றும் பல புற்றுநோய்களில் சாத்தியமான முன்கணிப்பு பயோமார்க்ஸராக இருக்கலாம்.
இந்த ஆய்வில், பெரிய அளவிலான CRISPRi செயல்பாட்டுத் திரையிடலைப் பயன்படுத்தி, PACT மற்றும் PKR ஆகிய இரண்டு முக்கிய அழுத்த பதிலளிப்பாளர்களை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் DARS-AS1 lncRNA புற்றுநோய் உயிரணு அழுத்தத்தை சமாளிக்கிறது என்பதை நாங்கள் தீர்மானித்தோம்.PACT உடன் நேரடியாக தொடர்புகொள்வதன் மூலம், DARS-AS1 ஆனது PACT-மத்தியஸ்த PKR செயல்பாட்டைத் தடுக்கிறது, இதன் மூலம் அப்போப்டொடிக் செல் இறப்பைத் தடுக்கிறது மற்றும் செல் பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது (படம் 5f).பல வகையான புற்றுநோய்களில் DARS-AS1 இன் உயர் கட்டுப்பாடு காணப்பட்டது, மன அழுத்த சூழ்நிலைகளில் புற்றுநோய் உயிரணு உயிர்வாழ்வதை ஊக்குவிக்கும் அதன் செயல்பாடு பல வகையான புற்றுநோய்களுக்கு பரவலாகப் பொருந்தும் என்று பரிந்துரைக்கிறது.
PACT ஆனது PKR ஆக்டிவேட்டர் புரதமாக அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளது, மேலும் PACT-மத்தியஸ்த PKR செயல்படுத்தல் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன், மொழிபெயர்ப்பு, அப்போப்டொசிஸ் மற்றும் பிற முக்கியமான செல்லுலார் செயல்முறைகளை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் அழுத்த பதில்களில் முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது62.பல தசாப்தங்களாக, PACT-PKR அடுக்கின் புற்றுநோய்-குறிப்பிட்ட ஒழுங்குமுறையைப் புரிந்துகொள்வதற்கான முயற்சிகள் மேற்கொள்ளப்பட்டுள்ளன.இங்கே, எங்கள் ஆய்வு செல்லுலார் lncRNA DARS-AS1 மூலம் புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் PACT-PKR ஐ ஒழுங்குபடுத்துவதற்கான வேறுபட்ட வழிமுறையை வெளிப்படுத்தியது, இது நேரடியாக PACT உடன் பிணைக்கிறது, PACT-PKR தொடர்புகளைத் தடுக்கிறது, PKR செயல்படுத்தல் மற்றும் eIF2α பாஸ்போரிலேஷனைத் தடுக்கிறது, இதனால் மன அழுத்தத்தால் தூண்டப்பட்ட அப்போப்டொசிஸ் மற்றும் அப்போப்டொசிஸைத் தடுக்கிறது. இறுதியில் புற்றுநோய் பெருக்கத்தை தூண்டுகிறது.செல்கள்.இந்த கண்டுபிடிப்பு புற்றுநோய் முன்கணிப்பு மற்றும் சிகிச்சைக்கான சாத்தியமான lncRNA இலக்குகளை வெளிச்சம் போட்டுக் காட்டுகிறது.
பாஸ்போரிலேட்டட் PKR மற்றும் eIF2α ஆகியவற்றில் குறிப்பிடத்தக்க அதிகரிப்புடன் DARS-AS1 நாக் டவுன் செல்களை சீரம் பட்டினிக்கு உணர்த்துகிறது என்பதை எங்கள் தரவு காட்டுகிறது.இந்த முடிவுகள் DARS-AS1 ஆனது PACT/PKR செயல்பாட்டைத் தடுப்பதன் மூலம் கடுமையான நிலைமைகளின் கீழ் புற்றுநோய் உயிரணுக்களின் உயிர்வாழ்வை ஊக்குவிக்கிறது.ASPACT மற்றும் nc886 போன்ற பல குறியீட்டு அல்லாத RNAகள் PACT48 mRNA ஐக் குறைப்பதன் மூலம் அல்லது PKR49,50,64 உடன் பிணைப்பதன் மூலம் ஆட்டோபாஸ்ஃபோரிலேஷனை ஒழுங்குபடுத்துவதன் மூலம் PACT/PKR அச்சில் ஈடுபட்டுள்ளன.அவற்றில், DARS-AS1 ஆனது PACT-PKR சங்கத்தை சீர்குலைப்பவராக செயல்படுகிறது.இந்த ஆய்வு PACT/PKR அச்சு ஒழுங்குமுறை மற்றும் மன அழுத்த பதில்களில் lncRNA களின் பங்கு பற்றிய நமது புரிதலை வளப்படுத்துகிறது.
PACT மூன்று தனித்தனி டொமைன்களைக் கொண்டுள்ளது.முதல் இரண்டு dsRBDகள் ஒவ்வொன்றும் PKR உடன் PACT இன் உயர் பிணைப்பை அடைவதற்கு போதுமானது, மூன்றாவது டொமைன் (D3) விட்ரோ மற்றும் விவோவில் PKR செயல்படுத்துவதற்கு தேவைப்படுகிறது.DARS-AS1 முன்னுரிமை D3 டொமைனுடன் தொடர்பு கொள்கிறது என்பதை எங்கள் ஆய்வு காட்டுகிறது (படம் 3h).எல்என்சிஆர்என்ஏ (768 நியூக்ளியோடைடுகள்) பெரிய அளவில் இருப்பதால், டி3யுடன் டிஏஆர்எஸ்-ஏஎஸ்1 பிணைப்பு, டிஎஸ்ஆர்பிடி மற்றும் பிகேஆர் ஆகியவற்றின் பிஏசிடி டொமைனுக்கு இடையேயான தொடர்புகளை உடல் ரீதியாகத் தடுக்கலாம், இதன் மூலம் பிஏசிடி மற்றும் பிகேஆர் தொடர்பைத் தடுக்கலாம்.D3 இல் Ser246 மற்றும் Ser287ஐ அலனைன் அல்லது அஸ்பார்டேட்டுடன் மாற்றிய PACT புள்ளி பிறழ்வுகள் DARS-AS1க்கான அதன் பிணைப்புத் தொடர்பை சீர்குலைத்து, அவற்றின் இணைப்பில் D3யின் ஒட்டுமொத்த கட்டமைப்பு மற்றும் மின் பண்புகளின் முக்கியத்துவத்தை சுட்டிக்காட்டுகிறது.மேலும் துல்லியமான உயிர்வேதியியல் பகுப்பாய்வு மற்றும் உயர் தெளிவுத்திறன் PACT கட்டமைப்பு பகுப்பாய்வு ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி, இந்த பொறிமுறையின் கூடுதல் விவரங்கள் எதிர்காலத்தில் தேவைப்படும்.
முந்தைய ஆய்வுகள் DARS-AS1 பல வழிமுறைகள் மூலம் செல் பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது 51,52,53.ஒரு எடுத்துக்காட்டில், சிறுநீரக புற்றுநோய் உயிரணுக்களில் miP-194-5p ஐ குறிவைத்து DARS-AS1 அதன் ஆன்டிசென்ஸ் புரத-குறியீட்டு DARS மரபணுவை அதிகப்படுத்தியதை ஆய்வாளர்கள் கவனித்தனர்.இருப்பினும், தற்போதைய ஆய்வில், DARS-AS1 நாக் டவுன் குறைந்த பட்சம் பெருங்குடல், மார்பகம் மற்றும் கல்லீரல் புற்றுநோய்கள் உட்பட பல வகையான புற்றுநோய்களில் DARS டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனில் சிறிய தாக்கத்தை ஏற்படுத்தியது.எல்என்சிஆர்என்ஏக்கள் செல் மற்றும் திசு-குறிப்பிட்ட வெளிப்பாடு வடிவங்களை வெளிப்படுத்துவதால், புற்றுநோய் வகைகளில் செயல்பாட்டு வழிமுறைகள் பாதுகாக்கப்படாமல் போகலாம், இது நமது அவதானிப்புகளுக்கும் வெவ்வேறு புற்றுநோய்களின் முந்தைய மதிப்பீடுகளுக்கும் இடையிலான இந்த முரண்பாட்டிற்கு பங்களிக்கக்கூடும்.பல்வேறு உடலியல் மற்றும் நோயியல் செயல்முறைகளின் குறிப்பிட்ட வழிமுறைகளை தெளிவுபடுத்த சிறப்பு ஆய்வுகள் தேவை.
மருத்துவத் தரவுகளின் பகுப்பாய்வு, கட்டிகளில் உள்ள DARS-AS1 வெளிப்பாடு புற்றுநோயாளிகளின் உயிர்வாழ்வோடு நேர்மாறாக தொடர்புடையது என்பதைக் காட்டுகிறது, இது புற்றுநோய் முன்கணிப்பில் DARS-AS1/PACT/PKR அச்சின் முக்கியத்துவத்தை அடிக்கோடிட்டுக் காட்டுகிறது.முடிவில், DARS-AS1 என்பது PACT/PKR சிக்னலிங் அச்சின் சீராக்கி, புற்றுநோய் செல் பெருக்கத்தை ஊக்குவிக்கிறது மற்றும் மன அழுத்தத்தின் போது அப்போப்டொசிஸைத் தடுக்கிறது, இது மற்றொரு ஆராய்ச்சியை வழங்குகிறது மற்றும் சாத்தியமான சிகிச்சைகள் குறித்த எதிர்கால ஆராய்ச்சிக்கு ஆர்வமாக உள்ளது என்பதை எங்கள் ஆய்வு காட்டுகிறது. .
மனித செல் கோடுகள் SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 மற்றும் HEK293T ஆகியவை சீனாவில் உள்ள தேசிய செல் லைன் வள உள்கட்டமைப்பிலிருந்து பெறப்பட்டன.அனைத்து செல்களும் டிஎம்இஎம் ஊடகத்தில் (டிஎம்இஎம், தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக், வால்தம், எம்ஏ) 10% FBS (ஜெமினி, புரூக்ளின், NY) மற்றும் 1% பென்சிலின்-ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்) 37°C, 5% CO2 இல் பராமரிக்கப்பட்டன.இன்குபேட்டர்.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);எதிர்ப்பு பிகேஆர், அப்காம் (ab184257);எதிர்ப்பு PKR (பாஸ்போ-T451), Abcam (ab81303);எதிர்ப்பு கொடி, அப்காம் (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764)) ;எதிர்ப்பு eIF2α (பாஸ்பரஸ் S51), Abcam (ab32157);எதிர்ப்பு PACT (பாஸ்பரஸ் S246), Abgent (AP7744b);எதிர்ப்பு β-tubulin, CST (2128);சாதாரண சுட்டி IgG, CST (5415S);சாதாரண முயல் IgG, CST (2729S).ஆன்டிபாடிகள் பிபிஎஸ்டியில் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டிங்கிற்காக 1:1000 மற்றும் ஐபிக்கு 1:100 என்ற அளவில் நீர்த்தப்பட்டன.
பொதுவில் கிடைக்கும் CRISPR-ERA66 என்ற கருவியைப் பயன்படுத்தி sgRNAகள் உருவாக்கப்பட்டன.sgRNA மேம்பாட்டிற்கான இயல்புநிலை கருவி அளவுருக்கள் மற்றும் 3 kb பகுதியில் அல்காரிதம் கணக்கிடப்பட்ட sgRNA பிணைப்பு தளங்களைப் பயன்படுத்தினோம்.TSS ஐ மையமாகக் கொண்டது.sgRNA ஒலிகோநியூக்ளியோடைடுகளின் குளங்கள் CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) இல் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு மனிதமயமாக்கப்பட்ட pgRNA பிளாஸ்மிட்களில் (Addgene #44248) குளோன் செய்யப்பட்டன.மொத்தம் 12 µg பூல் செய்யப்பட்ட மனிதமயமாக்கப்பட்ட pgRNA பிளாஸ்மிட், 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), மற்றும் 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) ஆகியவை டிஎன்ஏவில் 5 x 1036 செமீ டிஸ்கஸ் டிஎன்ஏவில் மாற்றியமைக்கப்பட்டது. செல்கள் (CWBIO, பெய்ஜிங், சீனா) உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களைப் பின்பற்றுகிறது.இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட 48 மற்றும் 72 மணிநேரங்களுக்குப் பிறகு வைரஸ் கொண்ட சூப்பர்நேட்டண்டுகள் சேகரிக்கப்பட்டு 0.45 µm வடிகட்டி மூலம் வடிகட்டப்பட்டன.திரையிடலுக்கு, dCas9/KRAB இணைவு புரதத்தை வெளிப்படுத்தும் SW620 செல்கள் வைரஸ் கடத்தல் மூலம் பெறப்பட்டன.மாற்றியமைக்கப்பட்ட SW620 செல்கள் 0.1-0.3 என்ற MOI இல் நான்கு சுயாதீன தொற்று சோதனைகளில் வைரஸ் நூலகத்தால் பாதிக்கப்பட்டன, மேலும் 2 நாட்களுக்கு 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) மாதிரி எடுக்கப்பட்டது.அதன்பிறகு, ஸ்கிரீனிங்கிற்காக குறைந்தபட்சம் 500 செல்கள்/எஸ்ஜிஆர்என்ஏ லைப்ரரி கவரேஜுடன் 18 நாட்கள் விட்ரோவில் செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன.
QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) அறிவுறுத்தல்களின்படி மரபணு DNA பிரித்தெடுக்கப்பட்டது.மொத்தத்தில், ஒரு உயிரியல் மறுமுறைக்கு 100 μg மரபணு டிஎன்ஏ நூலகத்தை உருவாக்க பயன்படுத்தப்பட்டது.sgRNA பகுதி இரண்டு சுற்று PCR மூலம் பெருக்கப்பட்டு பார்கோடு இணைக்கப்பட்டது.
PCR தயாரிப்புகள் நியூக்ளியோஸ்பின் ® ஜெல் மற்றும் PCR சுத்திகரிப்பு கருவி (MACHEREY-NAGEL, Düren, ஜெர்மனி; 740609.250) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்டன மற்றும் Qubit™ HS இரட்டை இழையுடைய DNA கண்டறிதல் கருவி (தெர்மோ ஃபிஷர் சயின்டிஃபிக்; Q32854) ஐப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டன.
செல் பெருக்கத்தை அளவிட MTS மதிப்பீடு பயன்படுத்தப்பட்டது.2000 செல்கள்/கிணறு என்ற ஆரம்ப அடர்த்தியில் 96-கிணறு தட்டுகளில் செல்கள் விதைக்கப்பட்டன.மொத்தம் 4-6 நாட்களுக்கு சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நேரத்தில் செல்களின் ஒப்பீட்டு எண்ணிக்கை தினசரி அளவிடப்படுகிறது.ஒவ்வொரு கிணறுக்கும், 20 μl MTS reagent (Promega) 100 μl DMEM உடன் நீர்த்தப்பட்டு, 4 மணிநேரத்திற்கு 37 ° C வெப்பநிலையில் அடைக்கப்படுகிறது, பின்னர் OD490 அளவிடப்பட்டது.
கோளங்களின் உருவாக்கத்தை பகுப்பாய்வு செய்வதன் மூலம் இணைக்கப்படாத வளர்ச்சிக்கான திறன் கண்டறியப்பட்டது.சுருக்கமாக, shRNA DARS-AS1 அல்லது கட்டுப்பாட்டு shRNA உடன் மாற்றப்பட்ட 2000 செல்கள் ஒவ்வொரு 4 நாட்களுக்கும் நடுத்தர மாற்றத்துடன் மிகக் குறைந்த இணைப்பு மைக்ரோ பிளேட்டுகளில் (கார்னிங்) வளர்க்கப்பட்டன.ஸ்பீராய்டுகள் 14 நாட்களுக்குப் பிறகு கணக்கிடப்பட்டன.DARS-AS1 ஓவர் எக்ஸ்பிரஷன் பிளாஸ்மிட் அல்லது ஒரு கண்ட்ரோல் பிளாஸ்மிட் மூலம் மாற்றப்பட்ட 500 செல்கள் விரிவாக்க மதிப்பீட்டிற்கு பயன்படுத்தப்பட்டன, இல்லையெனில் முறை மாறாமல் இருந்தது.
ரிபோப்ரோப்® காம்பினேஷன் சிஸ்டம்ஸ் (ப்ரோமேகா பி1440) அறிவுறுத்தல்களின்படி டி7 ஆர்என்ஏ பாலிமரேஸ் மற்றும் பயோட்டின்-16-யுடிபி (ரோச் 1138908910) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி ஆர்என்ஏ படியெடுக்கப்பட்டது.இங்கே பயன்படுத்தப்படும் ப்ரைமர்கள் துணை அட்டவணை 4 இல் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.
புரோட்டீன்-கோடிங் PACT அல்லது PKR பகுதிகள் pET15b (Addgene #73619) ஆக குளோன் செய்யப்பட்டு BL21(DE3) ஆக மாற்றப்பட்டது.ஆம்பிசிலின் வழங்கப்பட்ட எல்பியில் பாக்டீரியா ஒரே இரவில் அடைகாக்கப்பட்டு, பின்னர் புதிய எல்பியுடன் 100 மடங்கு நீர்த்தப்பட்டது.ஊடகத்தின் OD600 0.8 ஐ எட்டியபோது, ​​புரத வெளிப்பாட்டைத் தூண்ட 1 mM IPTG சேர்க்கப்பட்டது.மென்மையான குலுக்கலுடன் (20°C இல் 250 rpm) ஒரே இரவில் அடைகாத்த பிறகு, செல் துகள் மையவிலக்கு மூலம் சேகரிக்கப்பட்டது (4000 rpm, 10 நிமிடம், 4 ° C).லைசிஸ் பஃபரில் செல் பெல்லட்டை மீண்டும் இணைத்து (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ஐஸ் மீது 30 நிமிடம் அடைகாத்து, பிறகு சொனிகேட் (15 நிமிடம், 5 வினாடிகள் ஆன்/ஆஃப், ஐஸ் மீது) மற்றும் சென்ட்ரிஃப்யூஜ் (13,000) rpm)., 30 நிமிடம், 4°С).சூப்பர்நேட்டண்ட் பின்னர் Ni-NTA ரெசினில் (QIAGEN) 4 டிகிரி செல்சியஸில் 3 முறை ஏற்றப்பட்டது, வாஷ் பஃபருடன் 4 முறை கழுவப்பட்டது (50 mM டிரிஸ், pH 8.0, 40 mM இமிடாசோல், 250 mM NaCl) மற்றும் மொத்தம் 3 முறை நீக்கப்பட்டது. 10 மிலி எலுவென்ட் பஃபர் (50 எம்எம் டிரிஸ், பிஹெச் 8.0, 250 எம்எம் நாசிஎல், 300 எம்எம் இமிடாசோல்).WB ஐப் பயன்படுத்தி சுத்திகரிக்கப்பட்ட புரதம் தீர்மானிக்கப்பட்டது மற்றும் Qubit™ புரத மதிப்பீட்டு கருவியைப் பயன்படுத்தி செறிவு தீர்மானிக்கப்பட்டது (தெர்மோ ஃபிஷர் அறிவியல்; Q 33212).
RIP மதிப்பீடுகள் முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி மாற்றங்களுடன் செய்யப்பட்டன.சுருக்கமாக, 1x RIP தாங்கல் (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (பயோடைம் பயோடெக்னாலஜி), 1 mM DDM, கோடெய்ல் 1 ப்ரோடீஸ் (ரோச், 1 எம்எம் டிடிடி) மற்றும் மையவிலக்கு 13,000 ஆர்பிஎம்மில் 15 நிமிடம் 4 டிகிரி செல்சியஸ்.சூப்பர்நேட்டன்ட் பின்னர் 5 μg எதிர்ப்பு PACT ஆன்டிபாடி (Abeam) அல்லது IgG (CST) உடன் இணைந்த புரத A+G காந்த மணிகள் (மில்லிபோர்) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது.மணிகள் 5x RIP இடையகத்துடன் 5 முறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் புரோட்டினேஸ் K (NEB) மூலம் செரிக்கப்பட்டது.ஆர்என்ஏ டிரிசோல் மூலம் பிரித்தெடுக்கப்பட்டது மற்றும் RT-qPCR ஆல் தீர்மானிக்கப்பட்டது.ப்ரைமர்கள் துணை அட்டவணை 5 இல் வழங்கப்பட்டுள்ளன.
இன் விட்ரோ RIP மதிப்பீடு மாற்றியமைக்கப்பட்ட நிலையான RIP மதிப்பீட்டு நெறிமுறையின்படி செய்யப்பட்டது.மொத்தம் 5 பிஎம்எல் இன் விட்ரோ டிரான்ஸ்கிரிப்ட் ஆர்என்ஏ RIP பஃபருடன் 1x நீர்த்தப்பட்டு 65 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு அடைகாப்பதன் மூலம் அறை வெப்பநிலைக்கு மெதுவாக குளிர்விக்கப்பட்டது.மொத்தம் 5 பிஎம்எல் அப்படியே அல்லது பிறழ்ந்த கொடி-லேபிளிடப்பட்ட PACT புரதங்கள் E. coli இலிருந்து சுத்திகரிக்கப்பட்டன.4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 2 மணிநேரத்திற்கு மறுசீரமைக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவுடன் அடைகாத்து, கொடி எதிர்ப்பு ஐபிக்கான ஆர்ஐபி பகுப்பாய்விற்கு மேலே உள்ள நடைமுறையைப் பின்பற்றவும்.
ஆர்என்ஏ நீட்டிப்பு பகுப்பாய்விற்கு, 1x107 செல்கள் 1xRIP இடையகத்துடன் இணைக்கப்பட்டன.4 ° C இல் 15 நிமிடங்களுக்கு 13,000 rpm இல் மையவிலக்குக்குப் பிறகு, சூப்பர்நேட்டன்ட் 30 μl ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் காந்த மணிகளுடன் (பெக்மேன்) 4 ° C க்கு 2 மணிநேரத்திற்கு முன்கூட்டியே சிகிச்சையளிக்கப்பட்டது.பின்னர் சுத்திகரிக்கப்பட்ட லைசேட் ஈஸ்ட் டிஆர்என்ஏவுடன் வழங்கப்பட்டது மற்றும் 40 பிஎம்எல் மறுசீரமைக்கப்பட்ட ஆர்என்ஏவுடன் ஒரே இரவில் 4 டிகிரி செல்சியஸில் அடைகாக்கப்பட்டது, பின்னர் மேலும் 2 மணி நேரம் மற்றும் பிஎஸ்ஏ உடன் தடுக்கப்பட்ட 20 μl புதிய ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் காந்த மணிகள் சேர்க்கப்பட்டது.கழுவுதல் படி 5x RIP இடையகத்துடன் 4 முறை மற்றும் 1x RIP இடையகத்துடன் 4 முறை ஆகியவற்றைக் கொண்டுள்ளது.தொடர்புடைய புரதங்கள் பயோட்டின் எலுஷன் பஃபருடன் (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) நீக்கப்பட்டு NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) இல் பிரிக்கப்பட்டன.சில்வர் ஸ்டைனிங்கிற்குப் பிறகு (பயோடைம் பயோடெக்னாலஜி), சில பட்டைகள் MS ஆல் அகற்றப்பட்டு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.
PACT மற்றும் PKR க்கு இடையிலான தொடர்புகளை சோதிக்க கோ-ஐபி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.சுருக்கமாக, 1 x RIP பஃபரில் 1 x 107 லைஸ்டு செல்களை அடைகாப்பதன் மூலம் சூப்பர்நேட்டன்ட் லைசேட்டுகள் தயாரிக்கப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து 13,000 ஆர்பிஎம்மில் 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு மையவிலக்கு செய்யப்படுகிறது.லைசேட்டுகள் புரோட்டீன் A + G காந்த மணிகளால் ஏற்றப்பட்டு, 5 µg ஆன்டி-PACT ஆன்டிபாடியுடன் இணைக்கப்பட்டு, மெதுவாக ஒரே இரவில் 4 ° C இல் சுழற்றப்பட்டது.மணிகள் 5×RIP இடையகத்துடன் 3 முறையும், 1×RIP இடையகத்துடன் இரண்டு முறையும், 1×SDS இடையகத்துடன் எலுட் செய்யப்பட்டன.மீட்கப்பட்ட புரதம் SDS-PAGE ஜெல் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு WB ஆல் கண்டறியப்பட்டது.
கொடியிடப்பட்ட PACT இன் இரண்டு pmol மற்றும் PKR இன் 1 pmol ஆகியவை E. கோலியிலிருந்து சுத்திகரிக்கப்பட்டன.1× RIP பஃப்பரில் நீர்த்துப்போகச் செய்து, 4 °C வெப்பநிலையில் 2 மணி நேரம் ரீநேச்சர் செய்யப்பட்ட RNA 10 pmol உடன் அடைகாக்கவும்.அதன் பிறகு, அவை புரதம் A+G காந்த மணிகள்-இணைக்கப்பட்ட எதிர்ப்பு-லேபிளிடப்பட்ட ஆன்டிபாடியுடன் கூடுதலாக இரண்டு மணிநேரம் அடைகாத்தன.மணிகள் 1x RIP இடையகத்துடன் நான்கு முறை கழுவப்பட்டு 1x SDS இடையகத்துடன் நீக்கப்பட்டன.இதன் விளைவாக PACT மற்றும் PKR WB ஆல் கண்டறியப்பட்டது.