Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி.நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS ஆதரவு குறைவாக உள்ளது.சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்).இதற்கிடையில், தொடர்ந்து ஆதரவை உறுதிப்படுத்த, தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் வழங்குவோம்.
செயல்படுத்தப்பட்ட எஸ்டர்கள் அல்லது பினாக்ஸி ரேடிக்கல்களை அடிப்படையாகக் கொண்ட என்சைமேடிக் ப்ராக்ஸிமிட்டி லேபிளிங் முறைகள், உயிரணுக்களில் உள்ள துணைப் புரோட்டியோம்கள் மற்றும் புரோட்டீன் இன்டராக்டர்களை வரைபடமாக்க பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.இருப்பினும், செயல்படுத்தப்பட்ட எஸ்டர்கள் குறைவான வினைத்திறன் கொண்டவை, இதன் விளைவாக ஒரு பரந்த லேபிளிங் ஆரம் ஏற்படுகிறது, மேலும் பெராக்சைடு சிகிச்சையால் உருவாக்கப்படும் பினாக்ஸி ரேடிக்கல்கள் ரெடாக்ஸ் பாதைகளில் குறுக்கிடலாம்.மினிஎஸ்ஓஜி ஃபோட்டோசென்சிடைசர் புரதத்தை ஆர்வமுள்ள புரதத்துடன் மரபணு ரீதியாக இணைப்பதன் மூலம் உருவாக்கப்பட்ட ப்ராக்ஸிமிட்டி லேபிளிங் சார்பு ஃபோட்டோஆக்டிவேஷன் (பிடிபிஎல்) முறையை இங்கே நாங்கள் புகாரளிக்கிறோம்.நீல ஒளியால் தூண்டப்பட்டு, வெளிப்பாடு நேரத்தால் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறது, ஒற்றை ஆக்ஸிஜன் உருவாக்கப்படுகிறது, பின்னர் அனிலின் ஆய்வு மூலம் ஹிஸ்டைடின் எச்சங்களின் இடஞ்சார்ந்த முறையில் தீர்க்கப்பட்ட லேபிளிங் அடையப்படுகிறது.உறுப்பு-குறிப்பிட்ட புரோட்டியோம் மேப்பிங் மூலம் அதன் உயர் நம்பகத்தன்மையை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம்.PDPL ஐ TurboID உடன் ஒரு பக்கவாட்டு ஒப்பீடு PDPL இன் மிகவும் குறிப்பிட்ட மற்றும் விரிவான புரோட்டியோமிக் கவரேஜைக் காட்டுகிறது.அடுத்து, நோயுடன் தொடர்புடைய டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் கோஆக்டிவேட்டர் BRD4 மற்றும் E3 பார்கின் லிகேஸுக்கு PDPL ஐப் பயன்படுத்தினோம், மேலும் முன்னர் அறியப்படாத ஊடாடுபவர்களைக் கண்டறிந்தோம்.ஓவர் எக்ஸ்பிரஷன் ஸ்கிரீனிங் மூலம், Ssu72 மற்றும் SNW1 ஆகிய இரண்டு அறியப்படாத அடி மூலக்கூறுகள் பார்கினுக்கு அடையாளம் காணப்பட்டன, அதன் சிதைவு எங்கும் பரவும்-புரோட்டீசோம் பாதையால் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது.
புரத நெட்வொர்க்குகளின் துல்லியமான குணாதிசயம் பல அடிப்படை செல்லுலார் செயல்முறைகளுக்கு அடியில் உள்ளது.எனவே, புரத இடைவினைகளின் மிகவும் துல்லியமான ஸ்பேடியோடெம்போரல் மேப்பிங் உயிரியல் பாதைகள், நோய் நோயியல் மற்றும் சிகிச்சை நோக்கங்களுக்காக இந்த இடைவினைகளை சீர்குலைக்க ஒரு மூலக்கூறு அடிப்படையை வழங்கும்.இந்த நோக்கத்திற்காக, உயிரணுக்கள் அல்லது திசுக்களில் தற்காலிக தொடர்புகளைக் கண்டறியும் திறன் கொண்ட முறைகள் மிகவும் விரும்பத்தக்கவை.அஃபினிட்டி ப்யூரிஃபிகேஷன் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி (AP-MS) வரலாற்று ரீதியாக ஆர்வமுள்ள புரதங்களின் (POIs) பிணைப்பு கூட்டாளர்களை அடையாளம் காண பயன்படுத்தப்படுகிறது.அளவுசார் புரோட்டியோமிக்ஸ் முறைகளின் வளர்ச்சியுடன், Bioplex3.0 உருவாக்கப்பட்டது, இது AP-MS அடிப்படையிலான புரத நெட்வொர்க்குகளின் மிகப்பெரிய தரவுத்தளமாகும்.AP-MS மிகவும் சக்தி வாய்ந்தது என்றாலும், செல் சிதைவு மற்றும் பணிப்பாய்வு நீர்த்துப்போதல் ஆகியவை பலவீனமான மற்றும் நிலையற்ற பிணைப்பு இடைவினைகளுக்குச் சார்புடையவை மற்றும் சிதைவுக்கு முன் பிரிக்கப்படாத போலியான தொடர்பு ஜோடிகள் போன்ற பிந்தைய சிதைவு கலைப்பொருட்களை அறிமுகப்படுத்துகின்றன.
இந்தச் சிக்கல்களைத் தீர்க்க, குறுக்கு இணைப்புக் குழுக்களுடன் இயற்கைக்கு மாறான அமினோ அமிலங்கள் (UAA) மற்றும் நொதி அருகிலுள்ள லேபிளிங் (PL) தளங்கள் (எ.கா. APEX மற்றும் BioID)5 உருவாக்கப்பட்டுள்ளன.UAA முறை பல சூழ்நிலைகளில் வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தப்பட்டு, நேரடி புரதப் பசைகள் பற்றிய தகவலை அளித்தாலும், UAA செருகும் தளத்தின் தேர்வுமுறை இன்னும் தேவைப்படுகிறது.மிக முக்கியமாக, இது ஒரு ஸ்டோச்சியோமெட்ரிக் லேபிளிங் முறையாகும், இது லேபிளிங் நிகழ்வுகளின் வினையூக்க மாற்றத்தைக் கொண்டிருக்கவில்லை.இதற்கு நேர்மாறாக, பயோஐடி முறை போன்ற நொதி PL முறைகள், பொறிக்கப்பட்ட பயோட்டின் லிகேஸை POI7 உடன் இணைக்கின்றன, இது பின்னர் பயோட்டினைச் செயல்படுத்தி ஒரு எதிர்வினை பயோட்டினில்-AMP எஸ்டர் இடைநிலையை உருவாக்குகிறது.இந்த நொதியானது, ப்ராக்ஸிமல் லைசின் எச்சங்களைக் குறிக்கும் ஒரு செயல்படுத்தப்பட்ட பயோட்டின் "மேகம்" வினையூக்கி வெளியிடுகிறது.இருப்பினும், போதுமான லேபிளிடப்பட்ட சிக்னலைப் பெற BioID க்கு 12 மணிநேரத்திற்கு மேல் தேவைப்படுகிறது, இது தற்காலிகத் தீர்மானத்துடன் அதன் பயன்பாட்டைத் தடுக்கிறது.ஈஸ்ட் டிஸ்ப்ளேவை அடிப்படையாகக் கொண்ட இயக்கப்பட்ட பரிணாமத்தைப் பயன்படுத்தி, டர்போஐடி பயோஐடியை அடிப்படையாகக் கொண்டு வடிவமைக்கப்பட்டது, மேலும் 10 நிமிடங்களுக்குள் பயோட்டின் மூலம் திறமையான லேபிளிங்கை அனுமதிக்கிறது, மேலும் ஆற்றல்மிக்க செயல்முறைகளை ஆய்வு செய்ய அனுமதிக்கிறது.TurboID மிகவும் சுறுசுறுப்பாக இருப்பதாலும், குறைந்த-நிலை லேபிளிங்கிற்கு எண்டோஜெனஸ் பயோட்டின் அளவுகள் போதுமானதாக இருப்பதாலும், வெளிப்புற பயோட்டின் சேர்ப்பதன் மூலம் அதிக மேம்படுத்தப்பட்ட மற்றும் நேரமான லேபிளிங் தேவைப்படும்போது பின்னணி லேபிளிங் ஒரு சாத்தியமான சிக்கலாக மாறும்.கூடுதலாக, செயல்படுத்தப்பட்ட எஸ்டர்கள் மோசமாக வினைபுரியும் (t1/2 ~5 நிமிடம்), இது ஒரு பெரிய லேபிளிங் ஆரத்திற்கு வழிவகுக்கும், குறிப்பாக பயோட்டின் 5 உடன் அண்டை புரதங்களின் செறிவூட்டலுக்குப் பிறகு. மற்றொரு அணுகுமுறையில், பொறிக்கப்பட்ட அஸ்கார்பேட் பெராக்ஸிடேஸின் மரபணு இணைவு (அதாவது பயோட்டின்- ஃபீனால் ரேடிக்கல்கள் மற்றும் ஒரு நிமிடத்திற்குள் புரத லேபிளிங்கை அனுமதிக்கும் செல்லுலார் செயல்முறைகள்.
எனவே, செல்லுலார் பாதைகளை கணிசமாக சீர்குலைக்காமல் அதிக இடஞ்சார்ந்த மற்றும் தற்காலிக துல்லியத்துடன் அதிக எதிர்வினை லேபிளிடப்பட்ட-ஆரம் அடக்குமுறை இனங்களை உருவாக்கும் திறன் கொண்ட ஒரு புதிய முறை ஏற்கனவே உள்ள முறைகளுக்கு ஒரு முக்கியமான கூடுதலாக இருக்கும். எதிர்வினை உயிரினங்களில், சிங்கிள்ட் ஆக்ஸிஜன் அதன் குறுகிய வாழ்நாள் மற்றும் வரையறுக்கப்பட்ட பரவல் ஆரம் (செல்களில் t1/2 <0.6 µs) காரணமாக நம் கவனத்தைத் தூண்டியது. எதிர்வினை உயிரினங்களில், சிங்கிள்ட் ஆக்ஸிஜன் அதன் குறுகிய வாழ்நாள் மற்றும் வரையறுக்கப்பட்ட பரவல் ஆரம் (செல்களில் t1/2 <0.6 µs) காரணமாக நம் கவனத்தைத் தூண்டியது. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. செயலில் உள்ள வடிவங்களில், சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் அதன் குறுகிய வாழ்நாள் மற்றும் வரையறுக்கப்பட்ட பரவல் ஆரம் (செல்களில் t1/2 <0.6 µs) காரணமாக நம் கவனத்தை ஈர்த்தது.மேலும் 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). செயலில் உள்ள வடிவங்களில், ஒற்றை ஆக்ஸிஜன் அதன் குறுகிய வாழ்நாள் மற்றும் வரையறுக்கப்பட்ட பரவல் ஆரம் (செல்களில் t1/2 <0.6 μs) காரணமாக நம் கவனத்தை ஈர்க்கிறது.சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன், மெத்தியோனைன், டைரோசின், ஹிஸ்டைடின் மற்றும் டிரிப்டோபான் ஆகியவற்றைத் தோராயமாக ஆக்சிஜனேற்றம் செய்வதாகக் கூறப்படுகிறது, இது அமீன் அல்லது தியோல் அடிப்படையிலான ஆய்வுகள்16,17 உடன் இணைவதற்கு 14,15 துருவமாக மாற்றுகிறது.சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் சப்செல்லுலர் கம்பார்ட்மென்ட் ஆர்என்ஏவை லேபிளிடப் பயன்படுத்தப்பட்டாலும், எண்டோஜெனஸ் பிஓஐ ப்ராக்சிமிட்டி மார்க்கர்களை மீண்டும் உருவாக்குவதற்கான உத்திகள் ஆராயப்படாமல் இருக்கின்றன.இங்கே, ஃபோட்டோஆக்டிவேஷன்-சார்பு ப்ராக்சிமிட்டி லேபிளிங் (PDPL) எனப்படும் தளத்தை நாங்கள் வழங்குகிறோம், அங்கு மினிஎஸ்ஓஜி ஃபோட்டோசென்சிடைசருடன் இணைக்கப்பட்ட POI களை ஒளிரச் செய்ய நீல ஒளியைப் பயன்படுத்துகிறோம் மற்றும் அருகிலுள்ள எச்சங்களை ஆக்ஸிஜனேற்ற ஒற்றை ஆக்ஸிஜன் உருவாக்கத்தைத் தூண்டுகிறோம், அதைத் தொடர்ந்து ரசாயன ஆய்வுகளை ஆக்சிஜனேற்ற அமீன் கொண்ட மாற்றங்கள் இடைநிலை உயிரணுக்கள்..டேக் விவரக்குறிப்பை அதிகரிக்க வேதியியல் ஆய்வுகளின் குழுவை நாங்கள் சோதித்தோம் மற்றும் திறந்த புரோட்டியோமிக்ஸ் பணிப்பாய்வுகளைப் பயன்படுத்தி மாற்றியமைக்கும் தளங்களை அடையாளம் கண்டோம்.PDPL ஐ TurboID உடன் ஒரு பக்கவாட்டு ஒப்பீடு PDPL இன் மிகவும் குறிப்பிட்ட மற்றும் விரிவான புரோட்டியோமிக் கவரேஜைக் காட்டுகிறது.புற்றுநோயுடன் தொடர்புடைய எபிஜெனெடிக் ரெகுலேட்டரி புரோட்டீன் BRD4 மற்றும் பார்கின்சன் நோயுடன் தொடர்புடைய E3 லிகேஸ் பார்கின் ஆகியவற்றிற்கான பிணைப்பு கூட்டாளர்களின் துணை செல் புரோட்டியோமின் உறுப்பு-குறிப்பிட்ட குறிப்பான்களுக்கு இந்த அணுகுமுறையைப் பயன்படுத்தினோம். தொடர்புகள்..பெரிய புரத வளாகங்களில் E3 அடி மூலக்கூறுகளை அடையாளம் காணும் PDPL இன் திறன் மறைமுக பைண்டர்களின் அங்கீகாரம் தேவைப்படும் சூழ்நிலையைக் குறிக்கிறது.எங்கும் பரவும்-புரோட்டீசோம் மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட இரண்டு அறியப்படாத பார்கின் அடி மூலக்கூறுகள் சிட்டுவில் உறுதிப்படுத்தப்பட்டுள்ளன.
ஃபோட்டோடைனமிக் தெரபி (PDT)19 மற்றும் குரோமோஃபோர்-உதவி லேசர் செயலிழக்கச் செய்தல் (CALI)20, இதில் ஃபோட்டோசென்சிடைசர்களுடன் கூடிய ஒளி கதிர்வீச்சு ஒற்றை ஆக்ஸிஜனை உருவாக்குகிறது, இலக்கு புரதங்களை செயலிழக்கச் செய்யலாம் அல்லது உயிரணு இறப்பை ஏற்படுத்தலாம்.சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் என்பது சுமார் 70 nm கோட்பாட்டு பரவல் தூரம் கொண்ட மிகவும் வினைத்திறன் கொண்ட பொருளாக இருப்பதால், ஒளிச்சேர்க்கையைச் சுற்றியுள்ள இடஞ்சார்ந்த வரையறுக்கப்பட்ட ஆக்சிஜனேற்றத்தைக் கட்டுப்படுத்தலாம்.இந்த கருத்தின் அடிப்படையில், உயிரணுக்களில் உள்ள புரத வளாகங்களின் நெருக்கமான லேபிளிங்கை அடைய ஒற்றை ஆக்ஸிஜனைப் பயன்படுத்த முடிவு செய்தோம்.நான்கு செயல்பாடுகளை நிறைவேற்ற PDPL வேதியியல் அணுகுமுறையை நாங்கள் உருவாக்கியுள்ளோம்: (1) PL நொதி அணுகுமுறையைப் போன்ற செயலில் உள்ள சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜனின் உருவாக்கத்தை ஊக்குவிப்பதற்காக;(2) ஒளி துவக்கத்தின் போது நேரம் தீர்க்கப்பட்ட லேபிளிங்கை வழங்குதல்;(3) மாற்றத்தின் மூலம் (4) பின்னணியைக் குறைக்க எண்டோஜெனஸ் காஃபாக்டர்களை (பயோட்டின் போன்றவை) பயன்படுத்துவதைத் தவிர்க்கவும் அல்லது சுற்றுச்சூழல் அழுத்தத்திற்கு செல் வெளிப்பாட்டைக் குறைக்க மிகவும் குழப்பமான வெளிப்புற எதிர்வினைகளை (பெராக்சைடுகள் போன்றவை) பயன்படுத்தவும்.
சிறிய மூலக்கூறு எடை ஃப்ளோரோஃபோர்ஸ் (எ.கா. ரோஸ் பெங்கால், மெத்திலீன் நீலம்) 22 மற்றும் மரபணு குறியீடாக்கப்பட்ட சிறிய புரதங்கள் (எ.கா. miniSOG, KillerRed)23 உட்பட ஃபோட்டோசென்சிடிசர்களை இரண்டு வகைகளாகப் பிரிக்கலாம்.ஒரு மட்டு வடிவமைப்பை அடைய, POI24,25 (படம் 1a) இல் ஃபோட்டோசென்சிடைசர் (PS) புரதங்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் முதல் தலைமுறை PDPL இயங்குதளத்தை உருவாக்கினோம்.நீல ஒளியுடன் கதிரியக்கப்படும் போது, சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் ப்ராக்ஸிமல் நியூக்ளியோபிலிக் அமினோ அமில எச்சங்களை ஆக்சிஜனேற்றம் செய்கிறது, இதன் விளைவாக ஒரு umpolung துருவமுனைப்பு எலக்ட்ரோஃபிலிக் மற்றும் அமீன் ஆய்வு நியூக்ளியோபில்களுடன் மேலும் வினைபுரியும்.க்ளிக் கெமிஸ்ட்ரியை அனுமதிக்கவும், LC/MS/MS குணாதிசயத்திற்காக கீழே இழுக்கவும் ஒரு அல்கைன் கைப்பிடியுடன் ஆய்வு வடிவமைக்கப்பட்டுள்ளது.
miniSOG மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்யப்பட்ட புரத வளாகங்களின் லேபிளிங்கின் திட்டவட்டமான விளக்கம்.நீல ஒளிக்கு வெளிப்படும் போது, miniSOG-POI ஐ வெளிப்படுத்தும் செல்கள் ஒற்றை ஆக்ஸிஜனை உருவாக்குகின்றன, இது ஊடாடும் புரதங்களை மாற்றியமைக்கிறது, ஆனால் பிணைப்பு இல்லாத புரதங்களை அல்ல.ஒளி ஆக்சிஜனேற்றத்தின் இடைநிலை தயாரிப்புகள் அமீன் இரசாயன ஆய்வின் ரிலே லேபிள்களால் இடைமறித்து கோவலன்ட் அட்டெக்ட்களை உருவாக்குகின்றன.வேதியியல் ஆய்வில் உள்ள அல்கைனைல் குழுவானது, LC-MS/MS அளவைத் தொடர்ந்து கீழே இழுப்பதன் மூலம் செறிவூட்டுவதற்கு கிளிக் கெமிஸ்ட்ரியை அனுமதிக்கிறது.b அமீன் ஆய்வுகளின் வேதியியல் அமைப்பு 1-4.c 1-4 ஆய்வுகளைப் பயன்படுத்தி மைட்டோகாண்ட்ரியல் உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட மினிஎஸ்ஓஜி-மத்தியஸ்த புரோட்டியோமிக் குறிப்பான்களின் பிரதிநிதி ஃப்ளோரசன்ட் ஜெல் பகுப்பாய்வு மற்றும் ஜெல் டென்சிடோமெட்ரியின் அடிப்படையில் தொடர்புடைய அளவீடு.ரசாயன ஆய்வுகளின் சமிக்ஞை-பின்னணி விகிதம் நீல ஒளியைத் தவிர்த்து எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டு சோதனைகளைப் பயன்படுத்தி அல்லது மினிஎஸ்ஓஜி வெளிப்பாடு இல்லாமல் HEK293T செல்களைப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது.n = 2 உயிரியல் சார்பற்ற மாதிரிகள்.ஒவ்வொரு புள்ளியும் ஒரு உயிரியல் பிரதியைக் குறிக்கிறது.d சி போன்ற சுட்டிக்காட்டப்பட்ட PDPL கூறுகளின் முன்னிலையில் அல்லது இல்லாத நிலையில் உகந்த ஆய்வு 3 ஐப் பயன்படுத்தி PDPL இன் பிரதிநிதிகளைக் கண்டறிதல் மற்றும் அளவிடுதல்.n = 3 உயிரியல் சார்பற்ற மாதிரிகள்.ஒவ்வொரு புள்ளியும் ஒரு உயிரியல் பிரதியைக் குறிக்கிறது.மையக் கோடுகள் மற்றும் விஸ்கர்கள் சராசரி மற்றும் ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e கன்ஃபோகல் இமேஜிங் சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் மற்றும் ஃபார்-சிவப்பு Si-DMA கறை.அளவுகோல்: 10 µm.ஜெல் இமேஜிங் மற்றும் கன்ஃபோகல் பரிசோதனைகள் ஒரே மாதிரியான முடிவுகளுடன் குறைந்தபட்சம் இரண்டு முறை சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.
HEK293T இல் நிலையாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட முதிர்ந்த ஒளிச்சேர்க்கையாளர்களான miniSOG26 மற்றும் KillerRed23 ஆகியவற்றின் திறனை நாங்கள் முதலில் சோதித்தோம், புரோட்டியோமின் ப்ராபர்கிலாமைன் லேபிளிங்கை இரசாயன ஆய்வு (துணை படம் 1a).ஜெல் ஃப்ளோரசன்ஸ் பகுப்பாய்வு, மினிஎஸ்ஓஜி மற்றும் ப்ளூ லைட் கதிர்வீச்சைப் பயன்படுத்தி முழு புரோட்டீம் லேபிளிங் அடையப்பட்டது என்பதைக் காட்டுகிறது, அதே நேரத்தில் கில்லர்ரெடுடன் காணக்கூடிய லேபிளிங் தயாரிப்பு எதுவும் காணப்படவில்லை.சிக்னல்-க்கு-பின்னணி விகிதத்தை மேம்படுத்த, அனிலின் (1 மற்றும் 3), ப்ரோபிலமைன் (2) அல்லது பென்சிலமைன் (4) ஆகியவற்றைக் கொண்ட இரசாயன ஆய்வுகளின் தொகுப்பை நாங்கள் சோதித்தோம்.HEK293T செல்கள் நீல ஒளியுடன் ஒப்பிடும்போது அதிக பின்னணி சிக்னலைக் கொண்டிருப்பதை நாங்கள் கவனித்தோம், ஒருவேளை எண்டோஜெனஸ் ரிபோஃப்ளேவின் ஃபோட்டோசென்சிடைசர், ஃபிளவின் மோனோநியூக்ளியோடைடு (FMN) 27 . அனிலின் அடிப்படையிலான இரசாயன ஆய்வுகள் 1 மற்றும் 3 சிறந்த விவரக்குறிப்பை அளித்தன, HEK293T மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் miniSOG ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்துகிறது, ஆய்வு 3க்கான சமிக்ஞையில் 8 மடங்கு அதிகரிப்பைக் காட்டுகிறது, அதே நேரத்தில் RNA-லேபிளிங் முறையில் CAP-seq இல் பயன்படுத்தப்படும் ஆய்வு 2 ~2.5-ஐ மட்டுமே காட்டுகிறது. மடிப்பு சமிக்ஞை அதிகரிப்பு, ஆர்என்ஏ மற்றும் புரதம் (படம். 1 பி, சி) இடையே உள்ள வெவ்வேறு வினைத்திறன் விருப்பங்களின் காரணமாக இருக்கலாம். அனிலின் அடிப்படையிலான இரசாயன ஆய்வுகள் 1 மற்றும் 3 சிறந்த விவரக்குறிப்பை அளித்தன, HEK293T மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் miniSOG ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்துகிறது, ஆய்வு 3க்கான சமிக்ஞையில் 8 மடங்கு அதிகரிப்பைக் காட்டுகிறது, அதே நேரத்தில் RNA-லேபிளிங் முறையில் CAP-seq இல் பயன்படுத்தப்படும் ஆய்வு 2 ~2.5-ஐ மட்டுமே காட்டுகிறது. மடிப்பு சமிக்ஞை அதிகரிப்பு, ஆர்என்ஏ மற்றும் புரதம் (படம். 1 பி, சி) இடையே உள்ள வெவ்வேறு வினைத்திறன் விருப்பங்களின் காரணமாக இருக்கலாம்.அனிலின் அடிப்படையிலான இரசாயன ஆய்வுகள் 1 மற்றும் 3 சிறந்த விவரக்குறிப்பைக் காட்டுகின்றன: மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் miniSOG ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்தும் HEK293T, ஆய்வு 3க்கான சிக்னலில் 8 மடங்கு அதிகரிப்பைக் காட்டுகிறது, அதே சமயம் ஆய்வு 2, CAP-seq RNA லேபிளிங் முறையில் மட்டுமே பயன்படுத்தப்படுகிறது. ~2.5 மடங்கு சமிக்ஞை அதிகரிப்பைக் காட்டுகிறது, அநேகமாக ஆர்என்ஏ மற்றும் புரதங்களுக்கிடையேயான வெவ்வேறு வினைத்திறன் விருப்பங்கள் காரணமாக இருக்கலாம் (படம் 1 பி, சி).. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）。基于 苯胺 苯胺 化学 探针 1 和 3 具有 具有 更 的 ， ， Hek293T 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 3 的 信号 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAஅனிலின் அடிப்படையிலான இரசாயன ஆய்வுகள் 1 மற்றும் 3 சிறந்த தனித்தன்மையைக் கொண்டிருந்தன, HEK293T மைட்டோகாண்ட்ரியாவில் மினிஎஸ்ஓஜியை நிலையாக வெளிப்படுத்தியது, மேலும் ஆய்வு 3 சிக்னலில் 8 மடங்கு அதிகரிப்பைக் கொண்டிருந்தது, அதே சமயம் CAP-seq RNA லேபிளிங் முறைக்கான ஆய்வு 2 ~2.5 மடங்கு அதிகரிப்பை மட்டுமே காட்டியது.சிக்னலில், ஒருவேளை ஆர்என்ஏ மற்றும் புரதம் (படம். 1 பி, சி) இடையே வெவ்வேறு எதிர்வினை விருப்பங்கள் காரணமாக இருக்கலாம்.கூடுதலாக, ஆய்வு 3 ஐசோமர்கள் மற்றும் ஹைட்ராசைன் ஆய்வுகள் (ஆய்வுகள் 5, 6, 7) சோதனை செய்யப்பட்டன, இது ஆய்வு 3 (துணை படம் 1b, c) இன் மேம்படுத்தலை உறுதிப்படுத்துகிறது.இதேபோல், இன்-ஜெல் ஃப்ளோரசன்ஸ் பகுப்பாய்வு மற்ற உகந்த சோதனை அளவுருக்களை வெளிப்படுத்தியது: கதிர்வீச்சு அலைநீளம் (460 nm), இரசாயன ஆய்வு செறிவு (1 mM), மற்றும் கதிர்வீச்சு நேரம் (20 நிமிடம்) (துணை படம். 2a-c).PDPL நெறிமுறையில் ஏதேனும் ஒரு கூறு அல்லது படியைத் தவிர்ப்பது பின்னணியில் குறிப்பிடத்தக்க சமிக்ஞை மாற்றத்தை ஏற்படுத்தியது (படம். 1d).சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜனைத் தணிப்பதாக அறியப்படும் சோடியம் அசைட் அல்லது ட்ரோலாக்ஸ் முன்னிலையில் புரத லேபிளிங் கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டது குறிப்பிடத்தக்கது.ஒற்றை ஆக்ஸிஜனை நிலைப்படுத்த அறியப்படும் D2O இன் இருப்பு, லேபிளிங் சிக்னலை மேம்படுத்துகிறது.லேபிளிங்கில் மற்ற வினைத்திறன் ஆக்சிஜன் இனங்களின் பங்களிப்பை ஆராய, முறையே ஹைட்ராக்சில் மற்றும் சூப்பர் ஆக்சைடு ரேடிகல் ஸ்கேவெஞ்சர்களை நிறுவ மன்னிடோல் மற்றும் வைட்டமின் சி சேர்க்கப்பட்டன, ஆனால் அவை லேபிளிங்கைக் குறைப்பதாகக் கண்டறியப்படவில்லை.H2O2 சேர்ப்பது, ஆனால் வெளிச்சம் இல்லை, லேபிளிங்கில் விளைவதில்லை (துணை படம். 3a).Si-DMA ஆய்வுகளுடன் கூடிய ஃப்ளோரசன்ஸ் சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் இமேஜிங் HEK293T-miniSOG கம்பியில் சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் இருப்பதை உறுதி செய்தது, ஆனால் அசல் HEK293T கம்பியில் இல்லை.கூடுதலாக, mitoSOX Red ஒளியூட்டலுக்குப் பிறகு சூப்பர் ஆக்சைடு உற்பத்தியைக் கண்டறிய முடியவில்லை (படம். 1e மற்றும் துணைப் படம். 3b) 30. இந்தத் தரவுகள் சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன், அடுத்தடுத்த புரோட்டியோமிக் லேபிளிங்கிற்குப் பொறுப்பான முக்கிய எதிர்வினை ஆக்ஸிஜன் இனங்கள் என்று உறுதியாகக் கூறுகின்றன.நீல ஒளி கதிர்வீச்சு மற்றும் இரசாயன ஆய்வுகள் உட்பட PDPL இன் சைட்டோடாக்சிசிட்டி மதிப்பிடப்பட்டது, மேலும் குறிப்பிடத்தக்க சைட்டோடாக்சிசிட்டி எதுவும் காணப்படவில்லை (துணை படம் 4a).
லேபிளிங் பொறிமுறையைப் படிக்கவும், LC-MS/MS ஐப் பயன்படுத்தி புரத வளாகங்களின் புரோட்டியோமிக் அடையாளத்தை இயக்கவும், முதலில் எந்த அமினோ அமிலங்கள் மாற்றியமைக்கப்படுகின்றன மற்றும் ஆய்வு லேபிள்களின் டெல்டா நிறை ஆகியவற்றை நாம் முதலில் தீர்மானிக்க வேண்டும்.மெத்தியோனைன், ஹிஸ்டைடின், டிரிப்டோபன் மற்றும் டைரோசின் ஆகியவை சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன்14,15 மூலம் மாற்றியமைக்கப்படுவதாக தெரிவிக்கப்பட்டுள்ளது.MSFragger32 ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட FragPipe கம்ப்யூட்டிங் இயங்குதளத்தால் வழங்கப்படும் பாரபட்சமற்ற திறந்த தேடலுடன் TOP-ABPP31 பணிப்பாய்வுகளை ஒருங்கிணைக்கிறோம்.சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் மாற்றம் மற்றும் இரசாயன ஆய்வு லேபிளிங்கிற்குப் பிறகு, பிளவுபடுத்தக்கூடிய இணைப்பானைக் கொண்ட பயோட்டின் குறைப்பு லேபிளைப் பயன்படுத்தி கிளிக் கெமிஸ்ட்ரி செய்யப்பட்டது, அதைத் தொடர்ந்து நியூட்ராவிடின் நீட்சி மற்றும் டிரிப்சின் செரிமானம்.மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெப்டைட், இன்னும் பிசினுடன் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது, LC-MS/MS பகுப்பாய்வுக்காக ஃபோட்டோகிளீவ் செய்யப்பட்டது (படம் 2a மற்றும் துணைத் தரவு 1).பட்டியலிடப்பட்ட 50 பெப்டைட் மேப் (பிஎஸ்எம்) பொருத்தங்களுடன் புரோட்டியோம் முழுவதும் ஏராளமான மாற்றங்கள் நிகழ்ந்தன (படம் 2 பி).ஆச்சரியப்படும் விதமாக, ஹிஸ்டைடின் மாற்றத்தை மட்டுமே நாங்கள் கவனித்தோம், ஒருவேளை மற்ற அமினோ அமிலங்களை விட அனிலின் ஆய்வுகளை நோக்கி ஆக்ஸிஜனேற்றப்பட்ட ஹிஸ்டைடின் அதிக வினைத்திறன் காரணமாக இருக்கலாம்.சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் மூலம் ஹிஸ்டைடின் ஆக்சிஜனேற்றத்தின் வெளியிடப்பட்ட பொறிமுறையின்படி, +229 டாவின் முன்மொழியப்பட்ட டெல்டா-மாஸ் அமைப்பு இரண்டு ஆக்சிஜனேற்றங்களுக்குப் பிறகு 2-ஆக்ஸோ-ஹிஸ்டிடைனுடன் ஆய்வு 3 சேர்க்கைக்கு ஒத்திருக்கிறது, அதே நேரத்தில் +247 Da என்பது நீராற்பகுப்பு தயாரிப்பு ஆகும். இன் +229 டா (துணை படம் 5).MS2 ஸ்பெக்ட்ரமின் மதிப்பீடு, மாற்றியமைக்கப்பட்ட துண்டு அயனிகளை (y மற்றும் b) (படம் 2c) அடையாளம் காண்பது உட்பட, பெரும்பாலான y மற்றும் b அயனிகளின் அடையாளத்தின் உயர் நம்பகத்தன்மையைக் காட்டியது.PDPL-மாற்றியமைக்கப்பட்ட ஹிஸ்டைடின்களின் உள்ளூர் வரிசையின் சூழல் பகுப்பாய்வு, ±1 நிலைகளில் (துணை படம். 4b) சிறிய ஹைட்ரோபோபிக் எச்சங்களுக்கான மிதமான மையக்கருத்து விருப்பத்தை வெளிப்படுத்தியது.சராசரியாக, ஒரு புரதத்திற்கு 1.4 ஹிஸ்டைடின்கள் அடையாளம் காணப்பட்டன, மேலும் இந்த குறிப்பான்களின் தளங்கள் கரைப்பான் அணுகக்கூடிய மேற்பரப்பு பகுதி (SASA) மற்றும் உறவினர் கரைப்பான் கிடைக்கும் தன்மை (RSA) பகுப்பாய்வு (துணை படம். 4c,d) ஆகியவற்றால் தீர்மானிக்கப்பட்டது.
MSFragger மூலம் இயக்கப்படும் FragPipe கம்ப்யூட்டிங் இயங்குதளத்தைப் பயன்படுத்தி எஞ்சிய தெரிவுநிலையைப் படிப்பதற்கான ஒரு சார்பற்ற பணிப்பாய்வு.ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் பிசினிலிருந்து மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெப்டைட்களின் ஒளிக்கதிர்களை அனுமதிக்க கிளிக் வேதியியலில் பிளவுபடுத்தக்கூடிய இணைப்பிகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.பல மாற்றங்களையும், தொடர்புடைய எச்சங்களையும் அடையாளம் காண திறந்த தேடல் தொடங்கப்பட்டது.b புரோட்டீம் முழுவதும் நிகழும் மாற்றங்களின் வெகுஜனத்தை ஒதுக்கவும்.பெப்டைட் மேப்பிங் பிஎஸ்எம்.c MS2 ஸ்பெக்ட்ரல் சிறுகுறிப்பு ஹிஸ்டைடின் தளங்கள் ஆய்வு 3. ஒரு பிரதிநிதி உதாரணமாக, ஆய்வு 3 உடன் ஒரு கோவலன்ட் எதிர்வினை மாற்றியமைக்கப்பட்ட அமினோ அமிலத்துடன் +229.0938 Da ஐ சேர்த்தது.d பிறழ்வு மதிப்பீடு PDPL குறிப்பான்களை சோதிக்கப் பயன்படுகிறது.PRDX3 (H155A, H225A) மற்றும் PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ஆகியவை கொடி எதிர்ப்பு கண்டறிதலுக்காக காட்டு-வகை பிளாஸ்மிட்களுடன் மாற்றப்பட்டன.e செயற்கை பெப்டைட் ஆய்வு 3 முன்னிலையில் சுத்திகரிக்கப்பட்ட miniSOG உடன் வினைபுரிந்தது மற்றும் LC-MS ஸ்பெக்ட்ரமில் Δm +247 மற்றும் +229 உடன் தொடர்புடைய தயாரிப்புகள் குறிப்பிடப்பட்டன.f miniSOG-6xHis-tag மற்றும் anti-6xHis ஆன்டிபாடியுடன் மாதிரியான விட்ரோ புரதம்-க்கு-புரதம் இடைவினைகள்.ஆன்டிபயோடின் (ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-HRP) மற்றும் miniSOG-6xHis/anti-6xHis ஆன்டிபாடி காம்ப்ளக்ஸ்களின் ஆன்ட்டி-மவுஸ் வெஸ்டர்ன் பிளட் பகுப்பாய்வு, ஒளியின் வெளிப்பாட்டின் நேரத்தைப் பொறுத்து, ஆய்வு 3 என்று லேபிளிடப்பட்டுள்ளது.தனிப்பட்ட புரதங்களுக்கான லேபிள்கள் தொடர்புடைய மூலக்கூறு எடையில் வெளிப்படுத்தப்படுகின்றன: LC ஆன்டிபாடி லைட் செயின், HC ஆன்டிபாடி ஹெவி செயின்.இந்த சோதனைகள் ஒரே மாதிரியான முடிவுகளுடன் குறைந்தது இரண்டு முறை சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.
லேபிளிங் தளத்தின் உயிர்வேதியியல் சரிபார்ப்புக்காக, மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி மூலம் அடையாளம் காணப்பட்ட PRDX3 மற்றும் PRDX1 ஆகியவை ஹிஸ்டைடினில் இருந்து அலனைனுக்கு மாற்றப்பட்டு, இடமாற்றம் மதிப்பீடுகளில் காட்டு வகையுடன் ஒப்பிடப்பட்டன.PDPL முடிவுகள், பிறழ்வு லேபிளிங்கைக் கணிசமாகக் குறைத்தது (படம் 2d).இதற்கிடையில், திறந்த தேடலில் அடையாளம் காணப்பட்ட பெப்டைட் வரிசைகள் ஆய்வு 3 மற்றும் நீல ஒளியின் முன்னிலையில் சுத்திகரிக்கப்பட்ட miniSOG உடன் விட்ரோவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு வினைபுரிந்து, LC-MS ஆல் கண்டறியப்படும் போது +247 மற்றும் +229 Da வெகுஜன மாற்றத்துடன் தயாரிப்புகளை வழங்குகிறது (படம். . 2e).)மினிஎஸ்ஓஜி ஃபோட்டோஆக்டிவேஷனுக்குப் பதில் விட்ரோவில் ஊடாடும் ப்ராக்ஸிமல் புரோட்டீன்கள் லேபிளிடப்படுமா என்பதைச் சோதிக்க, மினிஎஸ்ஓஜி-6xஹிஸ் புரதம் மற்றும் விட்ரோவில் உள்ள அவரது மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (படம் 2எஃப்) ஆகியவற்றுக்கு இடையேயான தொடர்பு மூலம் செயற்கையான அருகாமை மதிப்பீட்டை வடிவமைத்தோம்.இந்த மதிப்பீட்டில், miniSOG உடன் ஆன்டிபாடி ஹெவி மற்றும் லைட் செயின்களின் ப்ராக்ஸிமல் லேபிளிங்கை எதிர்பார்த்தோம்.உண்மையில், மவுஸ் எதிர்ப்பு (6xHis-லேபிளிடப்பட்ட ஆன்டிபாடியின் கனமான மற்றும் லேசான சங்கிலிகளை அங்கீகரிப்பது) மற்றும் ஸ்ட்ரெப்டாவிடின் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்கள் கனமான மற்றும் லேசான சங்கிலிகளின் வலுவான பயோடைனிலேஷனைக் காட்டியது.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், 6xHis டேக் மற்றும் ஒளி மற்றும் கனமான சங்கிலிகளுக்கு இடையே உள்ள குறுக்கு இணைப்புகள் காரணமாக மினிஎஸ்ஓஜி ஆட்டோபயோடைனிலேஷனை நாங்கள் கவனித்தோம், இது லைசின் மற்றும் 2-ஆக்சோ-ஹிஸ்டிடின் ப்ராக்ஸிமல் ரெஸ்பான்ஸ் இடையே முன்பு விவரிக்கப்பட்ட இடைவெளியுடன் தொடர்புடையதாக இருக்கலாம்.முடிவில், பி.டி.பி.எல் ஹிஸ்டைடைனை அருகாமை சார்ந்த முறையில் மாற்றியமைக்கிறது என்று முடிவு செய்கிறோம்.
இன் சிட்டு லேபிளிங்கின் தனித்தன்மையை சோதிக்க துணைசெல்லுலர் புரோட்டியோமை வகைப்படுத்துவதே எங்கள் அடுத்த குறிக்கோளாக இருந்தது.எனவே, HEK293T கலங்களின் நியூக்ளியஸ், மைட்டோகாண்ட்ரியல் மேட்ரிக்ஸ் அல்லது வெளிப்புற ER சவ்வு (படம் 3a) ஆகியவற்றில் miniSOG ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்தினோம்.ஜெல் ஃப்ளோரசன்ஸ் பகுப்பாய்வானது மூன்று துணைக்கரு இடங்களில் ஏராளமான லேபிளிடப்பட்ட பட்டைகள் மற்றும் வெவ்வேறு லேபிளிங் முறைகளை வெளிப்படுத்தியது (படம். 3b).ஃப்ளோரசன்ஸ் இமேஜிங் பகுப்பாய்வு PDPL (படம் 3c) இன் உயர் குறிப்பிட்ட தன்மையைக் காட்டியது.PDPL பணிப்பாய்வு ஃப்ளோரசன்ஸ் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி துணை செல் புரோட்டியோம்களை வரையறுக்க ரோடமைன் சாயங்களைக் கொண்ட கிளிக் எதிர்வினைகளால் ஆனது, மேலும் PDPL சிக்னல்கள் DAPI, மைட்டோகாண்ட்ரியல் டிராக்கர்கள் அல்லது ER டிராக்கர்களுடன் இணைந்து, PDPL இன் உயர் நம்பகத்தன்மையை உறுதிப்படுத்துகின்றன.மூன்று உறுப்புகளின் இருப்பிடங்களுக்கு, அவிடின் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டைப் பயன்படுத்தி டர்போஐடியுடன் PDPL ஐப் பக்கவாட்டில் ஒப்பிட்டுப் பார்த்தால், அந்தந்த கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடும்போது PDPL இன்னும் குறிப்பாக லேபிளிடப்பட்டுள்ளது என்பதைக் காட்டுகிறது.PDPL நிலைமைகளின் கீழ், அதிக லேபிளிடப்பட்ட பட்டைகள் தோன்றின, இது அதிக PDPL-லேபிளிடப்பட்ட புரதங்களைக் குறிக்கிறது (துணை படம். 6a-d).
மினிஎஸ்ஓஜி-மத்தியஸ்த உறுப்பு-குறிப்பிட்ட புரோட்டியோம் லேபிளிங்கின் திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம்.miniSOG ஆனது மைட்டோகாண்ட்ரியல் மேட்ரிக்ஸை மனித COX4 (mito-miniSOG) இன் N-டெர்மினல் 23 அமினோ அமிலங்களுடன் இணைத்து, H2B (நியூக்ளியஸ்-miniSOG) க்கு இணைவு வழியாக அணுக்கருவையும், ER சவ்வின் (ER-miniSOG) சைட்டோபிளாஸ்மிக் பக்கத்தின் வழியாக Sec61β ஐயும் குறிவைக்கிறது. )அறிகுறிகளில் ஜெல் இமேஜிங், கன்ஃபோகல் இமேஜிங் மற்றும் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி ஆகியவை அடங்கும்.b மூன்று உறுப்பு-குறிப்பிட்ட PDPL சுயவிவரங்களின் பிரதிநிதி ஜெல் படங்கள்.CBB Coomassie புத்திசாலித்தனமான நீலம்.c HEK293T கலங்களின் பிரதிநிதி கன்ஃபோகல் படங்கள், V5 (சிவப்பு) என பெயரிடப்பட்ட ஆன்டிபாடி மூலம் கண்டறியப்பட்ட பல்வேறு துணை செல் உள்ளூர்மயமாக்கல்களுடன் miniSOG ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்துகிறது.மைட்டோகாண்ட்ரியா மற்றும் ER (பச்சை) ஆகியவற்றிற்கு துணை செல் குறிப்பான்கள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.PDPL பணிப்பாய்வு Cy3-azide கிளிக் வேதியியலைப் பயன்படுத்தி மினிஎஸ்ஓஜி (மஞ்சள்) பெயரிடப்பட்ட துணைசெல்லுலர் புரோட்டியோம்களைக் கண்டறிவதை உள்ளடக்கியது.அளவுகோல்: 10 µm.d லேபிளிடப்படாத அளவீடு மூலம் அளவிடப்பட்ட பல்வேறு உறுப்புகளில் PDPL-குறியிடப்பட்ட புரோட்டியோம்களின் எரிமலை அடுக்குகள் (n = 3 சுயாதீன உயிரியல் சோதனைகள்).இரண்டு வால் மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட் எரிமலை அடுக்குகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது.HEK293T காட்டு வகை எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிர வேறுபாடு). குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிர வேறுபாடு). Значительно измененные белки выделены красным цветом (ப <0,05 и >2-கிராட்னய ரசினிச மற்றும் இன்டென்ஸ்ஸிவ்ஸ்). குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் > அயனி தீவிரத்தில் 2 மடங்கு வேறுபாடு).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (ப <0,05 и > 2-கிராட்னிய ரஸ்னிஷா வ ионной силее). குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் > அயனி வலிமையில் 2 மடங்கு வேறுபாடு).HEK293T-miniSOGக்கு முக்கியமான, ஆனால் HEK293Tக்கு முக்கியமில்லாத தொடர்புடைய புரதங்கள் பச்சை நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.சோதனைகளிலிருந்து புரோட்டியோமிக் தரவுத்தொகுப்புகளின் தனித்தன்மையின் பகுப்பாய்வு டி.ஒவ்வொரு உறுப்புகளிலும் (சிவப்பு மற்றும் பச்சை புள்ளிகள்) புள்ளியியல் ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்க புரதங்களின் மொத்த எண்ணிக்கை மேலே குறிக்கப்பட்டுள்ளது.MitoCarta 3.0, GO பகுப்பாய்வு மற்றும் A. Ting et al ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் உறுப்புகளில் உள்ளமைக்கப்பட்ட புரதங்களை ஹிஸ்டோகிராம்கள் காட்டுகின்றன.மக்கள்.மைட்டோகாண்ட்ரியா, கருக்கள் மற்றும் ER ஆகியவற்றிற்கான தனி தரவுத்தொகுப்புகள்.இந்த சோதனைகள் ஒரே மாதிரியான முடிவுகளுடன் குறைந்தது இரண்டு முறை சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.
ஜெல் மற்றும் இமேஜிங் முடிவுகளால் ஊக்குவிக்கப்பட்டு, ஒவ்வொரு உறுப்புகளிலும் (துணைத் தரவு 2) அடையாளம் காணப்பட்ட புரோட்டியோமை அளவிட லேபிள்-இலவச அளவீடு பயன்படுத்தப்பட்டது.மாற்றப்படாத HEK293T பின்னணி குறிப்பான்களைக் கழிப்பதற்கு எதிர்மறைக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. எரிமலை சதி பகுப்பாய்வு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்கள் (p <0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிரம்) மற்றும் மினிஎஸ்ஓஜி-வெளிப்படுத்தும் கோடுகளில் மட்டுமே இருக்கும் சிங்கிள்டன் புரதங்கள் (படம். 3d சிவப்பு மற்றும் பச்சை புள்ளிகள்) காட்டப்பட்டது. எரிமலை சதி பகுப்பாய்வு குறிப்பிடத்தக்க அளவில் செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்கள் (p <0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிரம்) மற்றும் மினிஎஸ்ஓஜி-வெளிப்படுத்தும் கோடுகளில் மட்டுமே இருக்கும் சிங்கிள்டன் புரதங்கள் (படம். 3d சிவப்பு மற்றும் பச்சை புள்ளிகள்) காட்டப்பட்டது. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). எரிமலை சதி பகுப்பாய்வு கணிசமாக செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்கள் (p<0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிரம்) மற்றும் miniSOG-வெளிப்படுத்தும் கோடுகளில் மட்டுமே இருக்கும் ஒற்றை புரதங்களைக் காட்டியது (படம். 3d, சிவப்பு மற்றும் பச்சை புள்ளிகள்).火山图 分析 显示 出 富集 （（（p <0.05 和> 2 倍 倍 强度 以及 存 在于 min minisog 表达 中 单一 蛋白质 （3d 红色 红色火山图 分析 显示 出 （（（p <0.05 和> 2 倍 倍 强度） 仅 在于 在于 min மினிசாக் 表达 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点 。。。））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). எரிமலை சதி பகுப்பாய்வு குறிப்பிடத்தக்க வகையில் செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்கள் (p<0.05 மற்றும் >2x அயனி வலிமை) மற்றும் ஒற்றை புரதங்கள் miniSOG வெளிப்பாடு வரிசையில் மட்டுமே உள்ளது (படம் 3d இல் சிவப்பு மற்றும் பச்சை புள்ளிகள்).இந்தத் தரவை இணைத்து, முறையே 1364, 461 மற்றும் 911 புள்ளியியல் முக்கியத்துவம் வாய்ந்த அணுக்கரு, மைட்டோகாண்ட்ரியல் மற்றும் ER வெளிப்புற சவ்வு புரதங்களை அடையாளம் கண்டோம்.உறுப்பு-உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட PDPL இன் துல்லியத்தை பகுப்பாய்வு செய்ய, நாங்கள் MitoCarta 3.0, ஜீன் ஆன்டாலஜி (GO) பகுப்பாய்வு மற்றும் A. டிங் மற்றும் பலர் ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தினோம்.73.4, 78.5, மற்றும் 73.0% (படம் 3e) துல்லியத்துடன் தொடர்புடைய, கண்டறியப்பட்ட புரதங்களின் உறுப்புக் குறிப்பைச் சோதிக்க, மைட்டோகாண்ட்ரியா, நியூக்ளியஸ் மற்றும் ER க்கு தரவுத் தொகுப்பு8 பயன்படுத்தப்பட்டது.PDPL இன் தனித்தன்மை, உறுப்பு-குறிப்பிட்ட புரோட்டீம்களை அடையாளம் காண PDPL ஒரு சிறந்த கருவி என்பதை உறுதிப்படுத்துகிறது.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், அடையாளம் காணப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களின் சப்டோகாண்ட்ரியல் பகுப்பாய்வு, சிக்கிய புரோட்டியம் முக்கியமாக அணி மற்றும் உள் மென்படலத்தில் (முறையே 226 மற்றும் 106) விநியோகிக்கப்படுகிறது, இது அடையாளம் காணப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியல் புரதங்களின் மொத்த எண்ணிக்கையில் 91.7% (362) ஆகும்.PDPL இன் உயர் நிலை கூடுதலாக உறுதிப்படுத்தப்பட்டது (துணை படம். 7a).இதேபோல், சப்நியூக்ளியர் பகுப்பாய்வு, கைப்பற்றப்பட்ட புரோட்டியம் முக்கியமாக நியூக்ளியஸ், நியூக்ளியோபிளாசம் மற்றும் நியூக்ளியோலஸில் விநியோகிக்கப்படுகிறது என்பதைக் காட்டுகிறது (துணை படம். 7b).அணுக்கரு பரவல் சிக்னல் பெப்டைட் (3xNLS) உடனான அணு புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வு H2B கட்டமைப்பிற்கு ஒத்த துல்லியத்தைக் காட்டியது (துணை படம். 7c-h).பிடிபிஎல் மார்க்கரின் தனித்தன்மையைத் தீர்மானிக்க, அணுக்கரு லேமினின் ஏ மிகவும் தனித்தனியாக உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட POI7 பொறியாகத் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.பிடிபிஎல் 36 குறிப்பிடத்தக்க செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்களை அடையாளம் கண்டுள்ளது, அவற்றில் 12 புரதங்கள் (லேமின் ஏ உட்பட 30.0%) நன்கு வகைப்படுத்தப்பட்ட லேமின் ஏ ஊடாடும் புரதங்கள் சரம் தரவுத்தளத்தால் குறிக்கப்பட்டன, பயோஐடி முறையை விட அதிக சதவீதத்துடன் (122 புரதங்கள்) 28 இல் 28. , 22.9 %).GO பகுப்பாய்வு, அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்கள் முக்கியமாக நியூக்ளியோபிளாசம் (26), அணு சவ்வு (10), அணு சவ்வு (9) மற்றும் அணு துளைகள் (5) ஆகியவற்றில் அமைந்துள்ளன என்பதைக் காட்டுகிறது.ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த அணு-உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட புரதங்கள் 80% செறிவூட்டப்பட்ட புரதங்களைக் கொண்டிருந்தன, இது PDPL இன் தனித்தன்மையை மேலும் நிரூபிக்கிறது (துணை படம். 8a-d).
உறுப்புகளில் அருகாமையில் குறியிடும் PDPL இன் திறனை நிறுவிய பின்னர், POI பிணைப்பு கூட்டாளர்களை பகுப்பாய்வு செய்ய PDPL ஐப் பயன்படுத்த முடியுமா என்பதை நாங்கள் சோதித்தோம்.குறிப்பாக, சைட்டோசோலிக் புரதங்களின் பி.டி.பி.எல் பகுப்பாய்வை வரையறுக்க முயன்றோம், அவை அவற்றின் அதிக ஆற்றல்மிக்க தன்மையின் காரணமாக அவற்றின் சவ்வு-உள்ளூர்மயமாக்கப்பட்ட சகாக்களை விட மிகவும் கடினமான இலக்குகளாகக் கருதப்படுகின்றன.புரோமோடோமைன் மற்றும் எக்ஸ்ட்ராடெர்மினல் (BET) புரதம் BRD4 பல்வேறு நோய்களில் அதன் முக்கிய பங்கிற்காக நம் கவனத்தை ஈர்த்துள்ளது 35, 36 .BRD4 ஆல் உருவாக்கப்பட்ட சிக்கலானது ஒரு டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் கோஆக்டிவேட்டர் மற்றும் ஒரு முக்கியமான சிகிச்சை இலக்கு ஆகும்.c-myc மற்றும் Wnt5a டிரான்ஸ்கிரிப்ஷன் காரணிகளின் வெளிப்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம், BRD4 கடுமையான மைலோயிட் லுகேமியா (AML), மல்டிபிள் மைலோமா, புர்கிட்டின் லிம்போமா, பெருங்குடல் புற்றுநோய் மற்றும் அழற்சி நோய்கள் ஆகியவற்றின் முக்கிய நிர்ணயிப்பதாக கருதப்படுகிறது37,38.கூடுதலாக, சில வைரஸ்கள் பாப்பிலோமா வைரஸ், எச்ஐவி மற்றும் SARS-CoV-236,39 போன்ற வைரஸ் மற்றும் செல்லுலார் டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனைக் கட்டுப்படுத்த BRD4 ஐ குறிவைக்கின்றன.
PDPL ஐப் பயன்படுத்தி BRD4 தொடர்புகளை வரைபடமாக்க, BRD4 இன் குறுகிய N- அல்லது C-டெர்மினல் ஐசோஃபார்முடன் miniSOG ஐ இணைத்தோம்.புரோட்டியோமிக் முடிவுகள் இரண்டு கட்டுமானங்களுக்கிடையில் அதிக அளவு ஒன்றுடன் ஒன்று இருப்பதை வெளிப்படுத்தியது (துணை படம் 9a).miniSOG-H2B உடன் அடையாளம் காணப்பட்ட நியூக்ளியர் புரோட்டீம் BRD4 உடன் தொடர்பு கொள்ளும் 77.6% புரதங்களை உள்ளடக்கியது (துணை படம். 9b).பின்னர், மார்க்கர் ஆரம் (படம். 4a மற்றும் துணைத் தரவு 3) சரிசெய்ய வெவ்வேறு நேர வெளிச்சம் (2, 5, 10, 20 நிமிடம்) பயன்படுத்தப்பட்டது.குறுகிய ஒளிச்சேர்க்கைகளில், பிடிபிஎல் முதன்மையாக நேரடி பிணைப்பு கூட்டாளர்களை லேபிளிடும் என்று நாங்கள் முடிவு செய்கிறோம், அதே நேரத்தில் குறுகிய ஒளிச்சேர்க்கை காலங்களில் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்கள் மற்றும் லேபிளிங் வளாகங்களில் மறைமுக இலக்குகள் ஆகியவை அடங்கும்.உண்மையில், அருகிலுள்ள நேரப் புள்ளிகளுக்கு இடையே வலுவான ஒன்றுடன் ஒன்று இருப்பதைக் கண்டோம் (2 மற்றும் 5 நிமிடங்களுக்கு 84.6%; 5 மற்றும் 10 நிமிடங்களுக்கு 87.7%; 10 மற்றும் 20 நிமிடங்களுக்கு 98.7%) (படம். 4b மற்றும் துணைப் படம். 9c ).அனைத்து சோதனைக் குழுக்களிலும், BRD4 சுய-லேபிளிங் மட்டுமல்ல, MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A மற்றும் HMGB1 போன்ற பல அறியப்பட்ட இலக்குகள் சரம் தரவுத்தளத்தில் சிறுகுறிப்பு செய்யப்பட்டன.இந்த இலக்குகளின் அயனி வலிமை வெளிப்பாடு நேரத்திற்கு விகிதாசாரமாகும் (படம் 4c மற்றும் துணை படம் 9d).2-நிமிடக் குழுவில் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்களின் GO பகுப்பாய்வு, அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்கள் கருவில் உள்ளமைக்கப்பட்டு, குரோமாடின் மறுவடிவமைப்பு மற்றும் RNA பாலிமரேஸ் செயல்பாட்டில் ஈடுபட்டுள்ளன என்பதைக் காட்டுகிறது.புரதத்தின் மூலக்கூறு செயல்பாடு குரோமாடின் பிணைப்பு அல்லது டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் கோஆக்டிவேஷனில் செறிவூட்டப்பட்டது, இது BRD4 செயல்பாட்டிற்கு இசைவானது (படம் 4d).BRD4 மற்றும் HDAC பிணைப்பு அசிடைலேட்டட் ஹிஸ்டோன்களுடன் ஒத்துப்போகும் SIN3A, NCOR2, BCOR மற்றும் SAP130 (படம். 4e மற்றும் துணைப் படம். 9e) போன்ற BRD4 மற்றும் HDAC குடும்ப ஊடாடும் வளாகங்களுக்கு இடையேயான முதல் நிலை மறைமுகத் தொடர்புகளை சரம் தரவுத்தள-இயக்கப்பட்ட புரத தொடர்பு பகுப்பாய்வு வெளிப்படுத்தியது. ..கூடுதலாக, Sin3A, NSUN2, Fus மற்றும் SFPQ உள்ளிட்ட LC-MS/MS ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட பிரதிநிதி இலக்குகள் மேற்கத்திய ப்ளாட்டிங் மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டன (படம் 4f).சமீபத்தில், BRD4 இன் குறுகிய ஐசோஃபார்ம் திரவ-திரவ கட்டப் பிரிப்பு (LLPS) பண்புகளுடன் கருக்களை உருவாக்குவதாக அறிவிக்கப்பட்டது.RNA பிணைப்பு புரதங்களான Fus மற்றும் SFPQ ஆகியவை பல்வேறு செல்லுலார் செயல்முறைகளின் LLPS ஐ மத்தியஸ்தம் செய்கின்றன மற்றும் இங்கு பதிவு செய்யப்படாத BRD4 பிணைப்பு புரதங்களாக அடையாளம் காணப்பட்டுள்ளன.BRD4 மற்றும் SFPQ க்கு இடையேயான தொடர்பு இணை-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் (கோ-ஐபி) சோதனைகள் (படம் 4g) மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது, மேலும் விசாரணைக்கு தகுதியான BRD4-மத்தியஸ்த திரவ-திரவ கட்ட பிரிப்புக்கான மற்றொரு வழிமுறையை பரிந்துரைக்கிறது.ஒன்றாக எடுத்துக்கொண்டால், அறியப்பட்ட BRD4 தொடர்பு மற்றும் அறியப்படாத பிணைப்பு புரதங்களை அடையாளம் காண PDPL ஒரு சிறந்த தளம் என்று இந்த முடிவுகள் தெரிவிக்கின்றன.
மினிஎஸ்ஓஜி-மத்தியஸ்த BRD4 அருகாமையில் குறிக்கும் ஒரு திட்டவட்டமான பிரதிநிதித்துவம், வெளிப்பாடு நேரங்கள்: 2, 5, 10 மற்றும் 20 நிமிடம்.b வெவ்வேறு வெளிச்சம் நேரங்களில் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்களின் ஒன்றுடன் ஒன்று.காட்டு-வகை HEK293T உடன் ஒப்பிடும்போது HEK293T-miniSOG-BRD4 இல் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதச் செறிவூட்டல் புள்ளியியல் ரீதியாக குறிப்பிடத்தக்கது.c குறிப்பிடப்பட்ட வெளிப்பாடு நேரத்தில் அறியப்பட்ட BRD4-பிணைப்பு புரதங்களின் பெயரிடப்படாத பிரதிநிதியை அளவிடும் போது அயனி தீவிரம்.n = 3 உயிரியல் சார்பற்ற மாதிரிகள்.தரவு சராசரி ± நிலையான விலகலாக வழங்கப்படுகிறது.d 2 நிமிடக் குழுவில் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்களின் மரபணு இயக்கவியல் பகுப்பாய்வு (GO).முதல் பத்து GO விதிமுறைகள் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.GO கால வகையின்படி குமிழ்கள் வண்ணத்தில் உள்ளன, மேலும் குமிழி அளவு ஒவ்வொரு காலத்திலும் காணப்படும் புரதங்களின் எண்ணிக்கைக்கு விகிதாசாரமாகும்.e BRD4 உடன் தொடர்பு கொள்ளும் புரதங்களின் சரம் பகுப்பாய்வு.மஞ்சள் வட்டங்கள் நேரடி பசை மற்றும் சாம்பல் வட்டங்கள் மறைமுக பசையின் முதல் அடுக்கு ஆகும்.சிவப்பு கோடுகள் சோதனை ரீதியாக தீர்மானிக்கப்பட்ட இடைவினைகளையும் நீல கோடுகள் கணிக்கப்பட்ட இடைவினைகளையும் குறிக்கின்றன.f LC-MS/MS இல் அடையாளம் காணப்பட்ட பிரதிநிதி BRD4 பிணைப்பு இலக்குகள் மேற்கத்திய பிளாட்டிங் மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது.g கோ-இம்யூனோபிரெசிபிட்டேஷன் சோதனைகள் SFPQ மற்றும் BRD4 க்கு இடையிலான தொடர்புகளை உறுதிப்படுத்துகின்றன.இந்த சோதனைகள் ஒரே மாதிரியான முடிவுகளுடன் குறைந்தது இரண்டு முறை சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.
பதிவுசெய்யப்படாத POI-தொடர்புடைய இலக்குகளை அடையாளம் காண்பதுடன், என்சைம்களுக்கான அடி மூலக்கூறுகளை அடையாளம் காண PDPL பொருத்தமானதாக இருக்கும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம், இதற்கு பதிவு செய்யப்படாத அடி மூலக்கூறுகளை சிறுகுறிப்பு செய்ய பெரிய வளாகங்களில் மறைமுக பிணைப்பு புரதங்களின் தன்மை தேவைப்படும்.பார்கின் (PARK2 ஆல் குறியிடப்பட்டது) என்பது ஒரு E3 லிகேஸ் மற்றும் பார்க்கினில் உள்ள பிறழ்வுகள் ஆட்டோசோமால் ரீசீசிவ் ஜூவனைல் பார்கின்சன் நோயை (AR-JP) ஏற்படுத்துவதாக அறியப்படுகிறது.கூடுதலாக, மைட்டோபாகி (மைட்டோகாண்ட்ரியல் தன்னியக்கவியல்) மற்றும் எதிர்வினை ஆக்ஸிஜன் இனங்களை அகற்றுவதற்கு பார்கின் அவசியம் என்று விவரிக்கப்பட்டுள்ளது.இருப்பினும், பல பார்க்கின் அடி மூலக்கூறுகள் அடையாளம் காணப்பட்டாலும், இந்த நோயில் பார்க்கின் பங்கு தெளிவாக இல்லை.அதன் வகைப்படுத்தப்படாத அடி மூலக்கூறுகளைக் குறிப்பதற்காக, PDPL ஆனது பார்கின் N- அல்லது C-டெர்மினஸில் மினிஎஸ்ஓஜியைச் சேர்ப்பதன் மூலம் சோதிக்கப்பட்டது.PINK1-பார்கின் பாதை வழியாக பார்கினைச் செயல்படுத்த, செல்கள் கார்போனைல் சயனைடு புரோட்டான் டிரான்ஸ்போர்ட்டர் எம்-குளோரோஃபெனைல்ஹைட்ராசோன் (CCCP) மூலம் சிகிச்சையளிக்கப்பட்டன.எங்கள் BRD4 PDPL முடிவுகளுடன் ஒப்பிடும்போது, பார்கின் என்-டெர்மினஸ் இணைவு ஒரு பெரிய இலக்கு புரதங்களை வெளிப்படுத்தியது, இருப்பினும் இது சி-டெர்மினஸின் பெரிய பகுதியை உள்ளடக்கியது (210 இல் 177) (படம் 5a,b மற்றும் துணைத் தரவு 4).N-டெர்மினல் குறிச்சொற்கள் பார்கின் 44 ஐ தவறாக செயல்படுத்தலாம் என்ற அறிக்கைகளுடன் முடிவு ஒத்துப்போகிறது.ஆச்சரியப்படும் விதமாக, பார்கின் 43 க்கான வெளியிடப்பட்ட AP-MS முடிவுகளுடன் எங்கள் தரவுகளில் 18 ஒன்றுடன் ஒன்று புரதங்கள் மட்டுமே இருந்தன, இது செல் கோடுகள் மற்றும் புரோட்டியோமிக்ஸ் பணிப்பாய்வுகளுக்கு இடையிலான வேறுபாடுகள் காரணமாக இருக்கலாம்.நான்கு அறியப்பட்ட புரதங்களுடன் (ARDM1, HSPA8, PSMD14 மற்றும் PSMC3) இரண்டு முறைகளால் அடையாளம் காணப்பட்டது (படம். 5c)43.LC-MS/MS இன் முடிவுகளை மேலும் சரிபார்க்க, HEK293T பெற்றோர் செல் மதிப்பீடு மற்றும் நிலையான N-டெர்மினல் பார்கின் லைன் ஆகியவற்றின் முடிவுகளை ஒப்பிடுவதற்கு PDPL சிகிச்சை மற்றும் அடுத்தடுத்த மேற்கத்திய ப்ளாட்டிங் பயன்படுத்தப்பட்டது.முன்னர் அறியப்படாத இலக்குகளான CDK2, DUT, CTBP1 மற்றும் PSMC4 ஆகியவை DNAJB1 (படம் 5d) என்ற அறியப்பட்ட பைண்டர் மூலம் சோதிக்கப்பட்டன.
HEK293T கலங்களில் உள்ள பார்கின்-இன்டராக்டிங் புரோட்டீன்களின் எரிமலை சதி நிலையாக வெளிப்படுத்தப்பட்ட miniSOG உடன் N- அல்லது C-டெர்மினஸ் பார்கினுடன் இணைக்கப்பட்டது (n = 3 சுயாதீன உயிரியல் பரிசோதனைகள்).இரண்டு வால் மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட் எரிமலை அடுக்குகளில் பயன்படுத்தப்பட்டது.HEK293T எதிர்மறை கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிர வேறுபாடு). குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் >2-மடங்கு அயனி தீவிர வேறுபாடு). Значительно измененные белки выделены красным цветом (ப <0,05 и >2-கிராட்னய ரசினிச மற்றும் இன்டென்ஸ்ஸிவ்ஸ்). குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் > அயனி தீவிரத்தில் 2 மடங்கு வேறுபாடு).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (ப <0,05 и > 2-கிராட்னிய ரஸ்னிஷா வ ионной силее). குறிப்பிடத்தக்க வகையில் மாற்றப்பட்ட புரதங்கள் சிவப்பு நிறத்தில் சிறப்பிக்கப்படுகின்றன (p <0.05 மற்றும் > அயனி வலிமையில் 2 மடங்கு வேறுபாடு).HEK293T-miniSOGக்கு முக்கியமான, ஆனால் HEK293Tக்கு முக்கியமில்லாத தொடர்புடைய புரதங்கள் பச்சை நிறத்தில் காட்டப்பட்டுள்ளன.b வென் வரைபடம் N-டெர்மினல் மற்றும் சி-டெர்மினல் கட்டுமானங்களுக்கு இடையில் ஒன்றுடன் ஒன்று புரதங்களைக் காட்டுகிறது.N-டெர்மினல் குறிச்சொற்கள் பார்கினை தவறாக செயல்படுத்தி மேலும் அறியக்கூடிய புரதங்களை உருவாக்கலாம்.c Venn வரைபடம் PDPL மற்றும் AP-MS இடையே ஒன்றுடன் ஒன்று புரதங்களைக் காட்டுகிறது.PDPL இல் குறிப்பாக அடையாளம் காணப்பட்ட 18 ஒன்றுடன் ஒன்று புரதங்களில் 4 மற்றும் 159 புரதங்களில் 11 உட்பட அறியப்பட்ட ஊடாடுபவர்கள் பட்டியலிடப்பட்டுள்ளன.d LC-MS/MS ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட பிரதிநிதி இலக்குகள் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டிங் மூலம் சரிபார்க்கப்பட்டது.e Ssu72 மற்றும் SNW1 ஆகியவை பதிவு செய்யப்படாத பார்க்கின் அடி மூலக்கூறுகளாக அடையாளம் காணப்பட்டன.இந்த FLAG-குறியிடப்பட்ட புரத பிளாஸ்மிட்கள் HEK293T மற்றும் HEK293T-பார்கின்-மினிஎஸ்ஓஜிக்கு மாற்றப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து பல்வேறு நேர புள்ளிகளில் CCCP சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது.பார்க்கின் ஓவர் எக்ஸ்பிரஷன் கோட்டில் சீரழிவு அதிகமாகக் காணப்பட்டது.f புரோட்டீசோம் இன்ஹிபிட்டர் MG132 ஐப் பயன்படுத்தி, Ssu72 மற்றும் SNW1 இன் சிதைவு செயல்முறையானது புரோட்டீசோம்-எங்கும் பரவுதல் மூலம் மத்தியஸ்தம் செய்யப்படுகிறது என்பது உறுதிப்படுத்தப்பட்டது.இந்த சோதனைகள் ஒரே மாதிரியான முடிவுகளுடன் குறைந்தது இரண்டு முறை சுயாதீனமாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன.மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.
குறிப்பிடத்தக்க வகையில், PDPL ஆல் அடையாளம் காணப்பட்ட புரதங்களில் பார்க்கின்-பிணைப்பு புரதங்கள் மற்றும் அவற்றின் அடி மூலக்கூறுகள் இருக்க வேண்டும்.பதிவுசெய்யப்படாத பார்கின் அடி மூலக்கூறுகளைக் கண்டறிய, அடையாளம் காணப்பட்ட ஏழு புரதங்களைத் தேர்ந்தெடுத்தோம் (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 மற்றும் SNW1) மற்றும் இந்த மரபணுக்களை சாதாரண HEK293T க்கு வெளிப்படுத்த பிளாஸ்மிட்களை மாற்றியமைத்து, தொடர்ந்து miniSOG-Parkin's சிகிச்சையை தொடர்ந்து வெளிப்படுத்தினோம்.Ssu72 மற்றும் SNW1 புரதங்களின் அளவுகள் நிலையான miniSOG-பார்கின் வரிசையில் (படம் 5e) கணிசமாகக் குறைக்கப்பட்டன.CCCP உடன் 12 மணிநேரம் சிகிச்சையளித்ததன் விளைவாக இரண்டு அடி மூலக்கூறுகளின் மிக முக்கியமான சிதைவு ஏற்பட்டது.Ssu72 மற்றும் SNW1 இன் சீரழிவு புரோட்டீசோம்-எங்கும் பரவுதல் மூலம் கட்டுப்படுத்தப்படுகிறதா என்பதை ஆராய, புரோட்டீசோம் செயல்பாட்டைத் தடுக்க புரோட்டீசோம் இன்ஹிபிட்டர் MG132 சேர்க்கப்பட்டது, உண்மையில் அவற்றின் சிதைவு செயல்முறை தடுக்கப்பட்டதைக் கண்டறிந்தோம் (படம் 5f).கூடுதல் அடி மூலக்கூறு அல்லாத இலக்குகள் LC-MS/MS உடன் சீரான முடிவுகளைக் காட்டிய வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டிங் (துணை படம். 10) ஐப் பயன்படுத்தி பார்கின் இன்டராக்டர்களாக உறுதி செய்யப்பட்டன.முடிவில், இலக்கு புரத பரிமாற்ற சரிபார்ப்புடன் PDPL பணிப்பாய்வு ஒருங்கிணைப்பு பதிவு செய்யப்படாத E3 லிகேஸ் அடி மூலக்கூறுகளை அடையாளம் காண அனுமதிக்கிறது.
நாங்கள் ஒரு பொதுவான ப்ராக்சிமிட்டி மார்க்கிங் பிளாட்ஃபார்ம் ஒன்றை உருவாக்கியுள்ளோம், இது விண்வெளி மற்றும் நேர தொடர்பு POIகளை அடையாளம் காண உங்களை அனுமதிக்கிறது.இயங்குதளமானது miniSOG ஃபோட்டோசென்சிடைசர் புரதத்தை அடிப்படையாகக் கொண்டது, இது சுமார் 12 kDa மட்டுமே, முதிர்ந்த APEX2 நொதியின் (27 kDa) பாதி அளவு மற்றும் TurboID (35 kDa) அளவு மூன்றில் ஒரு பங்கு.சிறிய அளவு சிறிய புரத இடைவினைகளைப் படிப்பதற்கான பயன்பாடுகளின் வரம்பை பெரிதும் விரிவுபடுத்த வேண்டும்.ஒற்றை ஆக்ஸிஜனின் குவாண்டம் விளைச்சலை அதிகரிக்கவும், இந்த அணுகுமுறையின் உணர்திறனை விரிவுபடுத்தவும், மரபணு ரீதியாக குறியிடப்பட்ட புரதங்கள் அல்லது சிறிய மூலக்கூறுகளாக இருந்தாலும், கூடுதல் ஒளிச்சேர்க்கையாளர்களின் மேலும் ஆய்வு தேவைப்படுகிறது.miniSOG இன் தற்போதைய பதிப்பிற்கு, அருகாமை குறிப்பான்களை செயல்படுத்த நீல வெளிச்சத்தைப் பயன்படுத்தி உயர் தற்காலிகத் தீர்மானத்தை அடையலாம்.கூடுதலாக, நீண்ட வெளிப்பாடு நேரம் ஒற்றை ஆக்ஸிஜனின் ஒரு பெரிய "மேகம்" வெளியிடப்பட்டது, இதன் விளைவாக அதிக தொலைதூர ஹிஸ்டைடின் எச்சங்கள் மாற்றம், அதிகரித்த லேபிளிங் ஆரம் மற்றும் PDPL இடஞ்சார்ந்த தீர்மானத்தை நன்றாக மாற்றும் திறன்.சிக்னல்-க்கு-பின்னணி விகிதத்தை அதிகரிக்க ஏழு வேதியியல் ஆய்வுகளையும் நாங்கள் சோதித்தோம் மற்றும் இந்த அணுகுமுறையின் பின்னணியில் உள்ள மூலக்கூறு பொறிமுறையை ஆராய்ந்தோம்.TOP-ABPP பணிப்பாய்வு மற்றும் பக்கச்சார்பற்ற திறந்த தேடலுடன் இணைந்து ஹிஸ்டைடின்களில் மட்டுமே மாற்றங்கள் ஏற்பட்டதை உறுதிப்படுத்தியது மற்றும் லூப் பகுதியில் உள்ள ஹிஸ்டைடின்களுக்கு மிதமான விருப்பத்தைத் தவிர, அதிகரித்த ஹிஸ்டைடின் மாற்றங்களுக்கு நிலையான நுண்ணிய சூழல் எதுவும் காணப்படவில்லை.
பிடிபிஎல் துணைசெல்லுலர் புரோட்டீம்களை புரோட்டியோம் விவரக்குறிப்பு மற்றும் பாதுகாப்புடன் குறைந்தபட்சம் மற்ற அருகாமை லேபிளிங் மற்றும் உறுப்பு-குறிப்பிட்ட இரசாயன ஆய்வு முறைகளுடன் ஒப்பிடுவதற்குப் பயன்படுத்தப்படுகிறது.அருகாமை குறிப்பான்கள் மேற்பரப்பு, லைசோசோமால் மற்றும் சுரப்பு-தொடர்புடைய புரோட்டியோம்களை வகைப்படுத்தவும் வெற்றிகரமாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன46,47.இந்த துணை செல் உறுப்புகளுடன் PDPL இணக்கமாக இருக்கும் என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.கூடுதலாக, சைட்டோசோலிக் புரோட்டீன் பிணைப்புக்கான இலக்குகளை அடையாளம் காண்பதன் மூலம் பிடிபிஎல்-க்கு சவால் விட்டோம், அவை சவ்வு பிணைப்பு புரதங்களை விட அவற்றின் மாறும் பண்புகள் மற்றும் அதிக தற்காலிக தொடர்புகளில் ஈடுபடுவதால் அவை மிகவும் சிக்கலானவை.டிரான்ஸ்கிரிப்ஷனல் கோஆக்டிவேட்டர் BRD4 மற்றும் நோயுடன் தொடர்புடைய லிகேஸ் E3 பார்கின் ஆகிய இரண்டு புரதங்களுக்கு PDPL பயன்படுத்தப்பட்டது.இந்த இரண்டு புரதங்களும் அவற்றின் அடிப்படை உயிரியல் செயல்பாடுகளுக்கு மட்டுமல்ல, அவற்றின் மருத்துவத் தொடர்பு மற்றும் சிகிச்சைத் திறனுக்காகவும் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன.இந்த இரண்டு POI களுக்கும், நன்கு அறியப்பட்ட பிணைப்பு பங்காளிகள் மற்றும் பதிவு செய்யப்படாத இலக்குகள் அடையாளம் காணப்பட்டன.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், கட்டப் பிரிப்பு-தொடர்புடைய புரதம் SFPQ இணை-IP மூலம் உறுதிப்படுத்தப்பட்டது, இது BRD4 (குறுகிய ஐசோஃபார்ம்) LLPS ஐ ஒழுங்குபடுத்தும் ஒரு புதிய வழிமுறையைக் குறிக்கலாம்.அதே நேரத்தில், பார்கின் அடி மூலக்கூறுகளை அடையாளம் காண்பது மறைமுக பசைகளை அடையாளம் காண வேண்டிய ஒரு சூழ்நிலை என்று நாங்கள் நம்புகிறோம்.அடையாளம் காணப்படாத இரண்டு பார்கின் அடி மூலக்கூறுகளை நாங்கள் கண்டறிந்து, எங்கும் பரவும்-புரோட்டீசோம் பாதையில் அவற்றின் சிதைவை உறுதிப்படுத்தினோம்.சமீபத்தில், ஹைட்ரோலேஸ் அடி மூலக்கூறுகளை நொதிகள் மூலம் சிக்க வைப்பதன் மூலம் கண்டறிய ஒரு பொறிமுறை அடிப்படையிலான பொறி உத்தி உருவாக்கப்பட்டது.இது மிகவும் சக்திவாய்ந்த முறையாக இருந்தாலும், பெரிய வளாகங்களின் உருவாக்கத்தில் ஈடுபட்டுள்ள அடி மூலக்கூறுகளின் பகுப்பாய்விற்கு இது பொருந்தாது மற்றும் நொதிக்கும் அடி மூலக்கூறுக்கும் இடையில் கோவலன்ட் பிணைப்புகளை உருவாக்குவது தேவைப்படுகிறது.டியூபிக்விடினேஸ் மற்றும் மெட்டாலோபுரோட்டீஸ் குடும்பங்கள் போன்ற பிற புரத வளாகங்கள் மற்றும் என்சைம் குடும்பங்களைப் படிக்க PDPL விரிவாக்கப்படலாம் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்.
miniSOG இன் புதிய வடிவம், SOPP3 எனப்படும், மேம்படுத்தப்பட்ட ஒற்றை ஆக்ஸிஜன் உற்பத்தியுடன் உருவாக்கப்பட்டது.நாங்கள் miniSOG ஐ SOPP3 உடன் ஒப்பிட்டு, மேம்படுத்தப்பட்ட குறியிடல் செயல்திறனைக் கண்டறிந்தோம், இருப்பினும் சிக்னல்-க்கு-இரைச்சல் விகிதம் மாறாமல் இருந்தது (துணை படம். 11).SOPP3 இன் மேம்படுத்தல் (எ.கா., இயக்கப்பட்ட பரிணாமத்தின் மூலம்) குறைவான ஒளி நேரங்கள் தேவைப்படும் மிகவும் திறமையான ஒளிச்சேர்க்கை புரதங்களுக்கு வழிவகுக்கும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம், இதனால் அதிக ஆற்றல்மிக்க செல்லுலார் செயல்முறைகளைப் பிடிக்க முடியும்.குறிப்பிடத்தக்க வகையில், PDPL இன் தற்போதைய பதிப்பு செல்லுலார் சூழலுக்கு மட்டுப்படுத்தப்பட்டுள்ளது, ஏனெனில் அதற்கு நீல ஒளி வெளிச்சம் தேவைப்படுகிறது மற்றும் ஆழமான திசுக்களில் ஊடுருவ முடியாது.இந்த அம்சம் விலங்கு மாதிரி ஆய்வுகளில் அதன் பயன்பாட்டைத் தடுக்கிறது.இருப்பினும், பிடிபிஎல் உடன் ஆப்டோஜெனெடிக்ஸ் கலவையானது விலங்கு ஆராய்ச்சிக்கான வாய்ப்பை வழங்கக்கூடும், குறிப்பாக மூளையில்.கூடுதலாக, மற்ற பொறிக்கப்பட்ட அகச்சிவப்பு ஒளிச்சேர்க்கைகளும் இந்த வரம்பை நீக்குகின்றன.இந்த பகுதியில் தற்போது ஆய்வு நடந்து வருகிறது.
HEK293T செல் லைன் ATCC இலிருந்து பெறப்பட்டது (CRL-3216).செல் லைன் மைக்கோபிளாஸ்மா நோய்த்தொற்றுக்கு எதிர்மறையாக சோதிக்கப்பட்டது மற்றும் DMEM இல் வளர்க்கப்பட்டது (தெர்மோ, #C11995500BT) 10% கரு போவின் சீரம் (FBS, Vistech, #SE100-B) மற்றும் 1% பென்சிலின்/ஸ்ட்ரெப்டோமைசின் (Hyclone, #SV30010).வளர்ந்தது.
3-அமினோபெனிலீன் (மாதிரி 3) மற்றும் (4-எத்தினைல்பெனைல்) மெத்தனாமைன் (மாதிரி 4) ஆகியவை பிடெபார்மில் இருந்து வாங்கப்பட்டன.புரோபிலமைன் (ஆய்வு 2) ஆற்றல்-ரசாயனங்களிலிருந்து வாங்கப்பட்டது.N-(2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (ஆய்வு 1) வெளியிடப்பட்ட முறைகளின்படி ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது.
துணை அட்டவணை 1 இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்படும் மரபணு கட்டமைப்புகளை பட்டியலிடுகிறது.miniSOG மற்றும் KillerRed தொடர்கள் P. Zou (பீக்கிங் பல்கலைக்கழகம்) வழங்கிய பரிசு பிளாஸ்மிட்டிலிருந்து குளோன் செய்யப்பட்டன.மைட்டோகாண்ட்ரியல் மேட்ரிக்ஸ் இலக்கு வரிசை COX4 இன் 23 N-முனைய அமினோ அமிலங்களிலிருந்து பெறப்பட்டது மற்றும் கிப்சன் அசெம்பிளி (Beyotime, #D7010S) ஐப் பயன்படுத்தி சுட்டிக்காட்டப்பட்ட திசையன்களில் குளோன் செய்யப்பட்டது.எண்டோபிளாஸ்மிக் ரெட்டிகுலத்தின் சவ்வு மற்றும் கருவை குறிவைக்க, SEC61B மனித DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) HEK293T செல்களின் cDNA லைப்ரரியில் இருந்து PCR ஆல் பெருக்கப்பட்டது, மற்றும் H2B DNA (D. Lin, Shen ஆல் நன்கொடையாக) பேய் ஆய்வகம் மற்றும் குளோன் செய்யப்பட்ட , மேலே குறிப்பிட்டுள்ளபடி.வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், நிலையான செல் கோடுகளை மாற்றுவதற்கும் உருவாக்குவதற்கும் பயன்படுத்தப்படும் பிற புரத மரபணுக்கள் HEK293T செல் cDNA நூலகத்திலிருந்து PCR பெருக்கப்பட்டன.G3S (GGGS) மற்றும் G4S (GGGGS) ஆகியவை தூண்டில் புரதத்திற்கும் மினிஎஸ்ஓஜிக்கும் இடையே இணைப்பாளர்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன.இந்த இணைவு கட்டமைப்பில் V5 எபிடோப் டேக் (GKPIPNPLLGLDST) சேர்க்கப்பட்டது.பாலூட்டிகளின் வெளிப்பாடு மற்றும் ஒரு நிலையான செல் வரிசையை நிறுவ, miniSOG இணைவு கட்டமைப்பானது pLX304 லென்டிவைரல் வெக்டரில் துணைக் குளோன் செய்யப்பட்டது.பாக்டீரியா வெளிப்பாட்டிற்காக, சி-டெர்மினஸில் 6xHis என பெயரிடப்பட்ட pET21a வெக்டரில் miniSOG குளோன் செய்யப்பட்டது.
HEK293T செல்கள் ஆறு கிணறு தகடுகளில் ஒரு கிணற்றுக்கு 2.0 x 105 செல்கள் என்ற அளவில் விதைக்கப்பட்டு, 24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு மறுசீரமைப்பு லென்டிவைரல் பிளாஸ்மிட்கள் (2.4 μg pLX304) மற்றும் வைரஸ் பேக்கேஜிங் பிளாஸ்மிட்கள் (1.5 μg psPAX2 மற்றும் 1.2po.G0og ஐப் பயன்படுத்தி pBMDe8μ0g) , #C0533), சுமார் 80% இணைவு.ஒரே இரவில் இடமாற்றம் செய்யப்பட்ட பிறகு, ஊடகம் மாற்றப்பட்டு மேலும் 24 மணிநேரத்திற்கு அடைகாக்கப்பட்டது.வைரஸின் சேகரிப்பு 24, 48 மற்றும் 72 மணிநேரங்களுக்குப் பிறகு மேற்கொள்ளப்பட்டது.இலக்கு செல் கோடுகளின் தொற்றுக்கு முன், வைரஸ் ஊடகம் 0.8 μm வடிகட்டி (மெர்க், #மில்லெக்ஸ்-ஜிபி) மூலம் வடிகட்டப்பட்டது மற்றும் பாலிபிரீன் (சோலார்பியோ, #H8761) 8 μg/ml என்ற செறிவில் சேர்க்கப்பட்டது.24 மணி நேரத்திற்குப் பிறகு, ஊடகத்தை மாற்றுவதன் மூலம் செல்கள் மீட்க அனுமதிக்கப்பட்டன.குறைந்த கடுமையான தேர்வாக முதல் மூன்று பத்திகளுக்கு 5 μg/ml பிளாஸ்டிசிடின் (Solarbio, #3513-03-9) பயன்படுத்தி செல்கள் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டன.அடுத்த மூன்று பத்திகளுக்கு 20 μg/ml மிகவும் கடுமையான விதிமுறையாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.
ஒரு கிணற்றுக்கு தோராயமாக 20,000 செல்கள் அடர்த்தியில் 12-கிணறு அறைகளில் (Ibidi, #81201) செல்கள் விதைக்கப்பட்டன.HEK293T செல்களின் ஒட்டுதலை மேம்படுத்த, 50 µg/ml ஃபைப்ரோனெக்டினை (கார்னிங், #356008) பாஸ்பேட் பஃபர்டு சேலைனில் (PBS, Sangon, #B640435) 37°C இல் நீர்த்தவும்.அறைகள் 1 மணிநேரத்திற்கு முன்கூட்டியே சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டு பின்னர் பிபிஎஸ் மூலம் அகற்றப்பட்டன.24 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு, செல்கள் பிபிஎஸ் மூலம் ஒருமுறை கழுவப்பட்டு, புதிய ஹாங்க்ஸின் சமச்சீர் உப்புக் கரைசலில் (HBSS, கிப்கோ, #14025092) 1 மணிநேரத்திற்கு 37°C இல் 1 mM ஆய்வு 3 உடன் அடைகாத்து, பின்னர் நீல LED (460 nm) உடன் அடைகாக்கப்பட்டது. )) அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு கதிர்வீச்சு செய்யப்பட்டது.அதன் பிறகு, செல்கள் பிபிஎஸ் மூலம் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கு பிபிஎஸ்ஸில் (சாங்கோன், #E672002) 4% ஃபார்மால்டிஹைடுடன் சரி செய்யப்பட்டது.பிபிஎஸ் மூலம் மூன்று முறை கழுவுவதன் மூலம் நிலையான கலங்களிலிருந்து அதிகப்படியான ஃபார்மால்டிஹைட் அகற்றப்பட்டது.செல்கள் பிபிஎஸ்ஸில் 0.5% டிரைடன் எக்ஸ்-100 (சாங்கோன், #A600198) மூலம் ஊடுருவி, பிபிஎஸ் மூலம் 3 முறை கழுவப்பட்டது.பின்னர் அறையை அகற்றி, 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) கொண்ட கிளிக் ரியாக்ஷன் கலவையின் 25 µl ஒவ்வொரு மாதிரியிலும் சேர்க்கவும். மற்றும் 0.5 mg/ml சோடியம் அஸ்கார்பேட் (அலாடின், எண். S105024) மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் அடைகாக்கப்படுகிறது.ஒரு ஸ்னாப் எதிர்வினைக்குப் பிறகு, 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) கொண்ட PBS மூலம் செல்கள் ஆறு முறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு PBST இல் 5% BSA (Abcone, #B24726) மூலம் தடுக்கப்பட்டது.
கோலோகலைசேஷன் இம்யூனோஸ்டைனிங்கிற்காக, சுட்டிக்காட்டப்பட்ட நிபந்தனைகளின்படி முதன்மை ஆன்டிபாடிகளுடன் செல்கள் அடைக்கப்பட்டுள்ளன: மவுஸ் எதிர்ப்பு V5 டேக் mAb (1:500, CST, #80076), முயல் எதிர்ப்பு Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), ராபிட் பாலிகுளோனல் ஆன்டி-கால்னெக்சின் ஆன்டிபாடி (1:500, அப்காம், #ab22595) அல்லது ராபிட் ஆன்டி-லேமின் ஏ/சி மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (1:500; CST, #2032) ஒரே இரவில் 4 °C.பிபிஎஸ்டி மூலம் 3 முறை கழுவிய பிறகு, செல்கள் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளுடன் அடைகாத்தன: ஆடு முயல் எதிர்ப்பு அலெக்சா ஃப்ளூர் 488 (தெர்மோ, #A11034) 1:1000 நீர்த்த, ஆடு மவுஸ் எதிர்ப்பு அலெக்சா ஃப்ளூர் 594 (CST, #8889) 00001 நீர்த்த.நீர்த்தல் அறை வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்கள் நீர்த்தவும்.செல்கள் பிபிஎஸ்டியுடன் 3 முறை கழுவப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு பிபிஎஸ்ஸில் டிஏபிஐ (தெர்மோ, #D1306) உடன் எதிர்க்கறை செய்யப்பட்டன.பிபிஎஸ் மூலம் 3 முறை கழுவிய பிறகு, இமேஜிங்கிற்காக பிபிஎஸ்ஸில் 50% கிளிசரால் (சாங்கோன், #A600232) செல்கள் சீல் செய்யப்பட்டன.ZEISS LSM 900 Airyscan2 கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப் மற்றும் ZNE 3.5 மென்பொருளைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோஃப்ளோரசன்ட் படங்கள் பெறப்பட்டன.
சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் ஃப்ளோரசன்ட் இமேஜிங்கிற்கு, ஹாங்க்ஸ் ஹெப்ஸ் பஃப்பரில் (DOJINDO, #MT05) 100 nM Si-DMA ஐ சேர்ப்பதற்கு முன், செல்கள் இரண்டு முறை Hanks HEPES இடையகத்துடன் கழுவப்பட்டன.ஒளியை வெளிப்படுத்திய பிறகு, செல்கள் CO2 இன்குபேட்டரில் 37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 45 நிமிடங்களுக்கு அடைக்கப்பட்டுள்ளன.பின்னர் செல்கள் ஹாங்க்ஸின் HEPES இடையகத்துடன் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு ஹாங்க்ஸின் HEPES பஃப்பரில் Hoechst உடன் எதிர்க்கறை செய்யப்பட்டு ZEISS LSM 900 கன்ஃபோகல் மைக்ரோஸ்கோப்பைப் பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டது., #M36008) கால்சியம் மற்றும் மெக்னீசியம் கொண்ட HBSS இடையகத்தில்.ஒளி அல்லது டாக்ஸோரூபிகின் (MCE, #HY-15142A) வெளிப்பாட்டிற்குப் பிறகு, செல்கள் CO2 இன்குபேட்டரில் 37 ° C. 10 நிமிடங்களுக்கு அடைகாத்து, HBSS பஃபருடன் இரண்டு முறை கழுவி, அறை வெப்பநிலையில் HBSS பஃபரில் Hoechst உடன் அடைகாக்கப்பட்டது.நிமிடங்கள்.30 நிமிடங்களுக்கு 1% BSA ஐக் கொண்ட HBSS இல் 20 μM டாக்ஸோரூபிசினுடன் செல்கள் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட இடத்தில் டாக்ஸோரூபிகின் நேர்மறையான ஆய்வுக் கட்டுப்பாட்டாகப் பயன்படுத்தப்பட்டது.ஜீஸ் எல்எஸ்எம் 900 கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கியைப் பயன்படுத்தி இம்யூனோஃப்ளோரசன்ட் படங்கள் பெறப்பட்டன.
HEK293T செல்கள் mito-miniSOG ஐ நிலையாக வெளிப்படுத்துகின்றன, 15 செமீ உணவுகளில் தோராயமாக 30% அடர்த்தியில் விதைக்கப்பட்டன.48 மணிநேரத்திற்குப் பிறகு, ~80% சங்கமத்தை அடைந்தபோது, செல்கள் PBS மூலம் ஒருமுறை கழுவப்பட்டு, 1 mM Probe 3 உடன் புதிய HBSS பஃபரில் 1 மணிநேரம் 37°C வெப்பநிலையில் அடைக்கப்பட்டு, பின்னர் அறையில் 10 நிமிடங்களுக்கு நீல LED மூலம் ஒளிரச் செய்யப்பட்டது. வெப்ப நிலை..அதன் பிறகு, செல்கள் பிபிஎஸ் மூலம் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு, ஸ்க்ராப் செய்யப்பட்டு, EDTA இல்லாத புரோட்டீஸ் தடுப்பான்கள் (MCE, #HY-K0011) கொண்ட பனி-குளிர் பிபிஎஸ் பஃபரில் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டன.1 நிமிடம் (1 வினாடி ஆன் மற்றும் 1 வினாடி ஆஃப் 35% அலைவீச்சில்) நுனியை ஒலிக்கச் செய்வதன் மூலம் செல்கள் லைஸ் செய்யப்பட்டன.இதன் விளைவாக கலவையானது குப்பைகளை அகற்ற 10 நிமிடத்திற்கு 4 ° C இல் 15,871 xg இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது, மேலும் BCA புரத மதிப்பீட்டு கருவியைப் பயன்படுத்தி சூப்பர்நேட்டன்ட் செறிவு 4 mg/mL க்கு சரிசெய்யப்பட்டது (Beyotime, #P0009).மேலே உள்ள 1 மில்லி லைசேட்டை 0.1 mM ஒளிச்சேர்க்கை பயோட்டின் அசைடு (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA லிகண்ட் (அலாடின், #T162437) மற்றும் கீழே 1 mcubator உடன் இணைக்கவும். அறை வெப்பநிலையில் 1 மணி நேரம் வரை சுழற்சி.ஒரு ஸ்னாப் எதிர்வினைக்குப் பிறகு, கலவையை 10 மிலி கண்ணாடி குப்பியில் முன் கலந்த கரைசலில் சேர்க்கவும் (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml).அறை வெப்பநிலையில் 10 நிமிடங்களுக்கு மாதிரிகள் கலக்கப்பட்டு 4500 கிராம் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டன.கீழ் மற்றும் மேல் கரைசல்கள் நிராகரிக்கப்பட்டன, வீழ்படிவு 1 மில்லி மெத்தனால் மூலம் இரண்டு முறை கழுவப்பட்டு 4 ° C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கு 15871×g இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.25 மிமீ அம்மோனியம் பைகார்பனேட்டில் (ஏபிசி, அலாடின், எண். ஏ110539) 8 எம் யூரியாவை (அலாடின், எண். U111902) 1 மில்லி சேர்ப்பதன் மூலம் வீழ்படிவைக் கரைக்கவும்.மாதிரிகள் 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) 55°C இல் 40 நிமிடங்களுக்கு மறுகட்டமைக்கப்பட்டன, அதைத் தொடர்ந்து 15 mM புதிய iodoacetamide (Sangon, #A600539) இருட்டில் அறை வெப்பநிலையில் சேர்க்கப்பட்டது.30 நிமிடங்களுக்குள் அல்கைலேஷன்..எதிர்வினையை நிறுத்த கூடுதலாக 5 mM டிதியோத்ரைட்டால் சேர்க்கப்பட்டது.ஒவ்வொரு மாதிரிக்கும் தோராயமாக 100 µl நியூட்ராவிடின் அகரோஸ் மணிகளை (தெர்மோ, #29202) 1 மில்லி பிபிஎஸ் மூலம் 3 முறை கழுவவும்.மேலே உள்ள புரோட்டியோம் கரைசல் 5 மில்லி பிபிஎஸ் உடன் நீர்த்தப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 4 மணி நேரம் முன் கழுவிய நியூட்ராஅவிடின் அகரோஸ் மணிகளால் அடைகாக்கப்பட்டது.மணிகள் பின்னர் 0.2% SDS (Sangon, #A600485) கொண்ட 5 ml PBS உடன் 3 முறை, 1M யூரியாவைக் கொண்ட 5 ml PBS உடன் 3 முறை மற்றும் 5 ml ddH2O உடன் 3 முறை கழுவப்பட்டது.மணிகள் மையவிலக்கு மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டு, 1 M யூரியா, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) மற்றும் 20 ng/μl டிரிப்சின் (Promega, #V5280) ஆகியவற்றைக் கொண்ட 25 mM ABC இன் 200 μl இல் மீண்டும் இணைக்கப்பட்டன.37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒரே இரவில் டிரிப்சினைஸ் செய்யவும்.pH 2-3 ஐ அடையும் வரை ஃபார்மிக் அமிலத்தை (தெர்மோ, # A117-50) சேர்ப்பதன் மூலம் எதிர்வினை நிறுத்தப்பட்டது.மணிகள் 0.2% SDS கொண்ட 1 மில்லி PBS உடன் 3 முறையும், 1 M யூரியாவைக் கொண்ட 1 ml PBS உடன் 3 முறையும், பின்னர் 1 மில்லி காய்ச்சி வடிகட்டிய நீரில் 3 முறையும் கழுவப்பட்டன.மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் 70% MeOH இன் 200 μl ஐப் பயன்படுத்தி 90 நிமிடங்களுக்கு ஒளி சிதைவு (365 nm) மூலம் வெளியிடப்பட்டது.மையவிலக்குக்குப் பிறகு, சூப்பர்நேட்டண்ட் சேகரிக்கப்பட்டது.மணிகள் பின்னர் 100 μl 70% MeOH உடன் ஒரு முறை கழுவப்பட்டு, சூப்பர்நேட்டண்டுகள் பூல் செய்யப்பட்டன.மாதிரிகள் ஸ்பீட்வாக் வெற்றிட செறிவூட்டில் உலர்த்தப்பட்டு பகுப்பாய்வு வரை -20 ° C இல் சேமிக்கப்படும்.
சிங்கிள்ட் ஆக்சிஜன் மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகளைக் கண்டறிந்து அளவிட, மாதிரிகள் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டு, 1 μg பெப்டைடுகள் ஆர்பிட்ராப் ஃப்யூஷன் லுமோஸ் ட்ரிப்ரிட் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டனமாதிரிகள் 3 µm C18 மெட்டீரியல் (ReproSil-pur, #r13.b9.) உடன் 75 µm × 15 செமீ உட்புறமாக நிரம்பிய தந்துகி நிரலில் பிரிக்கப்பட்டு, EASY-nLC 1200 UHPLC அமைப்புடன் (தெர்மோ) இணைக்கப்பட்டது.8% கரைப்பான் B இலிருந்து 50% கரைப்பான் B (A = 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் தண்ணீரில், B = 0.1% ஃபார்மிக் அமிலம் 80% அசிட்டோனிட்ரைலில்) லீனியர் 95 நிமிட கிரேடியன்ட் குரோமடோகிராஃபி மூலம் பெப்டைடுகள் பிரிக்கப்பட்டன, பின்னர் நேர்கோட்டில் 98% B நிமிடத்திற்கு அதிகரிக்கப்பட்டது. 300 nl/min ஓட்ட விகிதத்தில் 6 நிமிடங்களில்.ஆர்பிட்ராப் ஃப்யூஷன் லுமோஸ் தரவைப் பொறுத்து முழு MS ஸ்கேன் மற்றும் MS2 ஸ்கேன் ஆகியவற்றுக்கு இடையே மாறி மாறி தரவைச் சேகரிக்கிறது.ஸ்பட்டரிங் மின்னழுத்தம் 2.1 kV ஆக அமைக்கப்பட்டது மற்றும் அயன் போக்குவரத்து தந்துகியின் வெப்பநிலை 320 ° C ஆக இருந்தது.MS ஸ்பெக்ட்ரா (350-2000 m/z) 120,000 தீர்மானம், AGC 4 × 105 மற்றும் அதிகபட்ச உள்ளீடு நேரம் 150 ms உடன் சேகரிக்கப்பட்டது.ஒவ்வொரு முழு ஸ்கேனிலும் மிகவும் பொதுவான 10 பெருக்கல் சார்ஜ் செய்யப்பட்ட முன்னோடிகள் HCD ஐப் பயன்படுத்தி 30% இயல்பான மோதல் ஆற்றல், 1.6 m/z ஒரு quadrupole தனிமைப்படுத்தல் சாளரம் மற்றும் 30,000 தெளிவுத்திறன் அமைப்பு ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி பிரிக்கப்பட்டன.5×104 மற்றும் அதிகபட்ச உள்ளீடு நேரம் 150 ms ஐப் பயன்படுத்தி டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரிக்கான AGC இலக்கு.டைனமிக் விதிவிலக்கு 30 வினாடிகளுக்கு அமைக்கப்பட்டுள்ளது. ஒதுக்கப்படாத அயனிகள் அல்லது 1+ மற்றும் >7+ கட்டணம் உள்ளவை MS/MSக்கு நிராகரிக்கப்பட்டன. ஒதுக்கப்படாத அயனிகள் அல்லது 1+ மற்றும் >7+ கட்டணம் உள்ளவை MS/MSக்கு நிராகரிக்கப்பட்டன. நேனாசென்னியோ அல்லது அயோனி 1+ மற்றும் >7+ பிலி ஆட்க்ளோனென்கள் வரை எம்.எஸ்./எம்.எஸ். ஒதுக்கப்படாத அயனிகள் அல்லது 1+ மற்றும் >7+ சார்ஜ் கொண்ட அயனிகள் MS/MSக்கு நிராகரிக்கப்பட்டன.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 நியுகசன்னியோ அல்லது அயோன்யோ சர்ஜரி 1+ மற்றும் >7+ பிலி ஆக்லோனென்கள் வரை எம்.எஸ்./எம்.எஸ். MS/MS க்கு 1+ மற்றும் >7+ கட்டணங்களைக் கொண்ட குறிப்பிடப்படாத அயனிகள் அல்லது அயனிகள் நிராகரிக்கப்பட்டன.
MSFragger ஐ அடிப்படையாகக் கொண்ட FragPipe கம்ப்யூட்டிங் தளத்தைப் பயன்படுத்தி மூலத் தரவு செயலாக்கப்படுகிறது.வெகுஜன சார்பு மற்றும் தொடர்புடைய அமினோ அமிலங்கள் -150 முதல் 500 டா வரையிலான முன்னோடி வெகுஜன சகிப்புத்தன்மையுடன் திறந்த தேடல் அல்காரிதம் மூலம் தீர்மானிக்கப்பட்டது.பிடியில் +229.0964 மற்றும் +247.1069 Da (Proteome Discoverer 2.5, Thermo) ஆகியவற்றின் வெகுஜன ஆதாயங்களுடன் ஹிஸ்டைடின் மாற்றங்களைப் பயன்படுத்தி மாற்றியமைக்கப்பட்ட பெப்டைடுகள் அடையாளம் காணப்பட்டன.
இணைந்த miniSOG மரபணுவை நிலையாக வெளிப்படுத்தும் செல்கள் 6 செமீ உணவுகளில் பூசப்பட்டன.~80% சங்கமத்தை அடைந்ததும், செல்கள் HBSS (கிப்கோ, #14025092) மூலம் ஒருமுறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் HBSS இல் 37°C வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் இரசாயன ஆய்வுகள் மூலம் அடைகாக்கப்பட்டு நீல ஒளியால் ஒளிரச் செய்யப்பட்டது.அறை வெப்பநிலையில் 20 நிமிடங்களுக்கு 10W LED.PDPL இல் எந்த வகையான எதிர்வினை ஆக்ஸிஜன் இனங்கள் ஈடுபட்டுள்ளன என்பதைத் தீர்மானிக்க, 0.5 mM வைட்டமின் C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (சிக்மா, #7789-20-0) , 100 mM மன்னிடோல் (ஆற்றல் இரசாயனம், #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 ஆகியவை கலங்களில் கூடுதல் பொருட்களாக சேர்க்கப்பட்டன.குளிர்ந்த பிபிஎஸ் மூலம் கழுவிய பிறகு, செல்கள் துடைக்கப்பட்டு, 1.5 மில்லி மையவிலக்குக் குழாய்களில் சேகரிக்கப்பட்டு, 200 μl பிபிஎஸ்ஸில் 1x புரோட்டீஸ் இன்ஹிபிட்டருடன் EDTA இல்லாமல் (1 வி மற்றும் 1 வி இல்லாமல், வீச்சு 35%) 1 நிமிடம் ஒரு முனையுடன் ஒலிக்கப்பட்டது.இதன் விளைவாக கலவையானது 10 நிமிடத்திற்கு 15,871 × g இல் 4 °C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது மற்றும் BCA புரத மதிப்பீட்டு கருவியைப் பயன்படுத்தி சூப்பர்நேட்டன்ட் செறிவு 1 mg/mL க்கு சரிசெய்யப்பட்டது.மேற்கூறிய லைசேட்டின் தோராயமாக 50 µl 0.1 mM ரோடமைன் அசைடு (அலாடின், எண். T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA லிகண்ட் மற்றும் 1 mM CuSO4 ஆகியவற்றுடன் அறை வெப்பநிலையில் கீழிருந்து மேல் சுழற்சியுடன் 1 மணிநேரம் அடைகாக்கப்பட்டது.கிளிக் எதிர்வினைக்குப் பிறகு, மாதிரிகளில் 250 μl முன் குளிரூட்டப்பட்ட அசிட்டோனைச் சேர்ப்பதன் மூலம் அசிட்டோனுடன் கூடிய மழைப்பொழிவு மேற்கொள்ளப்பட்டது, 20 நிமிடங்களுக்கு -20 ° C இல் அடைகாத்து, 4 ° C இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 6010×g இல் மையவிலக்கு செய்யப்படுகிறது.உருண்டையைச் சேகரித்து, 50 µl 1x லெம்மிலியின் பஃப்பரில் 95 °C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடம் வேகவைக்கவும்.பின்னர் SDS-PAGE நீண்ட ஜெல்களில் மாதிரிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு, இமேஜ் லேப் டச் மென்பொருளுடன் Bio-rad ChemiDoc MP டச் இமேஜிங் சிஸ்டத்தைப் பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
மறுசீரமைப்பு miniSOG-6xHis புரதத்தின் வெளிப்பாடு மற்றும் சுத்திகரிப்பு முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி செய்யப்பட்டது.சுருக்கமாக, E. coli BL21(DE3) செல்கள் (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis உடன் மாற்றப்பட்டது மற்றும் புரத வெளிப்பாடு 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168) மூலம் தூண்டப்பட்டது.உயிரணு சிதைவுக்குப் பிறகு, Ni-NTA அகரோஸ் மணிகளைப் பயன்படுத்தி புரதங்கள் சுத்திகரிக்கப்பட்டன (MCE, எண். 70666), பிபிஎஸ்க்கு எதிராக டயாலிஸ் செய்யப்பட்டு –80°C இல் சேமிக்கப்பட்டது.
ஆன்டிபாடி அடிப்படையிலான இன் விட்ரோ லேபிள் அருகாமை மதிப்பீட்டிற்கு, பிபிஎஸ்ஸில் 100 μM சுத்திகரிக்கப்பட்ட miniSOG, 1 mM ஆய்வு 3 மற்றும் 1 μg ஆன்டி-லேபிள் மவுஸ் மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (TransGen, #HT501-01) ஆகியவற்றை மொத்த எதிர்வினை அளவு 50 μlக்கு கலக்கவும்..எதிர்வினை கலவையானது அறை வெப்பநிலையில் 0, 2, 5, 10 மற்றும் 20 நிமிடங்களுக்கு நீல LED ஒளியுடன் கதிர்வீச்சு செய்யப்பட்டது.இந்த கலவையானது 0.1 mM பயோட்டின்-PEG3-azide (அலாடின், #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA லிகண்ட் மற்றும் 1 mM CuSO4 ஆகியவற்றுடன் அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரத்திற்கு மேல்நோக்கி இயக்க ஷேக்கரில் அடைக்கப்பட்டது.ஒரு ஸ்னாப் ரியாக்ஷனுக்குப் பிறகு, 4x லெம்ம்லியின் இடையகத்தை நேரடியாக கலவையில் சேர்த்து 95°C வெப்பநிலையில் 10 நிமிடம் கொதிக்க வைக்கவும்.SDS-PAGE ஜெல்களில் மாதிரிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு ஸ்ட்ரெப்டாவிடின்-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068) மூலம் வெஸ்டர்ன் ப்ளாட்டிங் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
சி-டெர்மினல் அமிடேஷன் (LHDALDAK-CONH2) உடன் ஹிஸ்டைடின் கொண்ட செயற்கை பெப்டைட் அருகிலுள்ள பெப்டைட் அடிப்படையிலான விட்ரோ லேபிளிங்கை பகுப்பாய்வு செய்ய பயன்படுத்தப்பட்டது.இந்த மதிப்பீட்டில், 100 μM சுத்திகரிக்கப்பட்ட miniSOG, 10 mM ஆய்வு 3 மற்றும் 2 μg/ml செயற்கை பெப்டைட் ஆகியவை பிபிஎஸ்ஸில் மொத்த எதிர்வினை அளவு 50 μl இல் கலக்கப்பட்டன.எதிர்வினை கலவையானது அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரத்திற்கு நீல LED ஒளியுடன் கதிர்வீச்சு செய்யப்பட்டது.ஒரு மைக்ரோலிட்டர் மாதிரி LC-MS அமைப்பைப் பயன்படுத்தி பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது (வாட்டர்ஸ், SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight Mass spectrometer with MassLynx spectrum analysis software).
HEK293T செல்கள் மினிஎஸ்ஓஜி இணைவு மரபணுவை நிலையாக வெளிப்படுத்தும் வெவ்வேறு உறுப்புகளின் உள்ளூர்மயமாக்கல் (மிட்டோ, ஈஆர், நியூக்ளியஸ்) கொண்ட கோடுகளுக்கு 10 செ.மீ உணவுகள் மற்றும் பார்கின்-மினிஎஸ்ஓஜி மற்றும் பிஆர்டி4-மினிஎஸ்ஓஜி கோடுகளுக்கு 15 செமீ உணவுகள் விதைக்கப்பட்டன.~90% சங்கமத்தை அடைந்ததும், செல்கள் HBSS உடன் ஒரு முறை கழுவப்பட்டு, பின்னர் HBSS இல் 37 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரத்திற்கு ஆய்வு 3 உடன் அடைகாக்கப்பட்டு, அறை வெப்பநிலையில் 10 W நீல LED மூலம் ஒளிரச் செய்யப்பட்டது.பார்கின் தொடர்பு இல்லாத லேபிளிங்கிற்காக, HBSS இல் ஆய்வு 3 உடன் 10 µM புரோட்டான் கார்போனைல் சயனைடு கேரியர் m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 1 மணிநேரத்திற்கு 37°C இல் சேர்க்கப்பட்டது.செல் சிதைவு, க்ளிக் கெமிஸ்ட்ரி, குறைப்பு மற்றும் அல்கைலேஷன் படிகள் மேலே விவரிக்கப்பட்டதைப் போலவே இருந்தன, தவிர 2 மில்லிகிராம் லைசேட் சேர்க்கப்பட்டது மற்றும் பயோட்டின் PEG3 அசைடு கிளிக் வினையில் ஒளிச்சேர்க்கை பயோட்டின் அசைடுக்கு பதிலாக பயன்படுத்தப்பட்டது.செறிவூட்டப்பட்ட பிறகு, மணிகள் 0.2% SDS கொண்ட 5 மில்லி PBS உடன் 3 முறையும், 1 M யூரியாவைக் கொண்ட 5 ml PBS உடன் 3 முறையும், 5 ml PBS உடன் 3 முறையும் கழுவப்பட்டன.அதன்பிறகு, 2 µg டிரிப்சின் 300 µl 25 mM ABC க்கு 1 M யூரியாவைக் கொண்டு புரதத்தை ஒரே இரவில் 37 ° C இல் பிளவுபடுத்துகிறது.2-3 pH ஐ அடையும் வரை ஃபார்மிக் அமிலத்தைச் சேர்ப்பதன் மூலம் எதிர்வினை நிறுத்தப்பட்டது.மணிகளில் ட்ரிப்சினைசேஷனுக்குப் பிறகு, பெப்டைட் கரைசல் SOLAµ HRP நெடுவரிசையைப் பயன்படுத்தி (தெர்மோ, #60209-001) உப்புநீக்கம் செய்யப்பட்டு ஸ்பீட்வாக் வெற்றிட செறிவூட்டில் உலர்த்தப்பட்டது.பெப்டைடுகள் 0.1% ஃபார்மிக் அமிலத்தில் மீண்டும் கரைக்கப்பட்டன மற்றும் மேலே விவரிக்கப்பட்ட நானோ-ESI மூலத்துடன் கூடிய ஆர்பிட்ராப் ஃப்யூஷன் லுமோஸ் ட்ரிப்ரிட் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி 500 என்ஜி பெப்டைடுகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டன.பெப்டைடுகள் வணிகரீதியான RP-HPLC முன்கோடுகள் (75 μm x 2 cm) (தெர்மோ, எண். 164946) மற்றும் பகுப்பாய்வு RP-HPLC நெடுவரிசைகள் (75 μm x 25 செ.மீ.) (தெர்மோ, எண். 164941) ஆகியவற்றில் பிரிக்கப்பட்டன, இவை இரண்டும் 2 μm நிரப்பப்பட்டுள்ளன.60 நிமிடங்களில் 8% இலிருந்து 35% ACN வரை சாய்வு, பின்னர் 300 Nl/min ஓட்ட விகிதத்தில் 6 நிமிடங்களில் 98% Bக்கு நேர்கோட்டில் அதிகரித்தது.MS ஸ்பெக்ட்ரா (350-1500 m/z) 60,000 தீர்மானம், AGC 4 × 105 மற்றும் அதிகபட்ச உள்ளீடு நேரம் 50 ms உடன் சேகரிக்கப்பட்டது.தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட அயனிகள் 3 வினாடி சுழற்சிகளில் HCD ஆல் 30% இயல்பான மோதல் ஆற்றல், 1.6 m/z ஒரு quadrupole தனிமைப்படுத்தல் சாளரம் மற்றும் 15000 தீர்மானம். 5 × 104 டேன்டெம் மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமீட்டர் AGC இலக்கு மற்றும் அதிகபட்சம் 22 எம்எஸ் பயன்படுத்தப்பட்டது.டைனமிக் விலக்கு 45 வினாடிகளுக்கு அமைக்கப்பட்டுள்ளது. ஒதுக்கப்படாத அயனிகள் அல்லது 1+ மற்றும் >7+ கட்டணம் உள்ளவை MS/MSக்கு நிராகரிக்கப்பட்டன. ஒதுக்கப்படாத அயனிகள் அல்லது 1+ மற்றும் >7+ கட்டணம் உள்ளவை MS/MSக்கு நிராகரிக்கப்பட்டன. நேனாசென்னியோ அல்லது அயோனி 1+ மற்றும் >7+ பிலி ஆட்க்ளோனென்கள் வரை எம்.எஸ்./எம்.எஸ். ஒதுக்கப்படாத அயனிகள் அல்லது 1+ மற்றும் >7+ சார்ஜ் கொண்ட அயனிகள் MS/MSக்கு நிராகரிக்கப்பட்டன.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 நியுகசன்னியோ அல்லது அயோன்யோ சர்ஜரி 1+ மற்றும் >7+ பிலி ஆக்லோனென்கள் வரை எம்.எஸ்./எம்.எஸ். MS/MS க்கு 1+ மற்றும் >7+ கட்டணங்களைக் கொண்ட குறிப்பிடப்படாத அயனிகள் அல்லது அயனிகள் நிராகரிக்கப்பட்டன.
NeutrAvidin மணிகளின் செறிவூட்டல் வரையிலான மாதிரி தயாரிப்பு படிகள் மேலே விவரிக்கப்பட்ட LC-MS/MS பகுப்பாய்வில் உள்ளதைப் போலவே இருந்தன.ஏறக்குறைய 50 μg லைசேட் ஏற்றுதல் கட்டுப்பாட்டிற்கு உள்ளீடாகவும், கிளிக் வினைகளுக்கு 2 mg லைசேட் பயன்படுத்தப்பட்டது.செறிவூட்டல் மற்றும் நியூட்ராவிடின் மூலம் கழுவிய பிறகு, 50 μl லெம்ம்லியின் இடையகத்தை அகரோஸ் பிசின் மணிகளுடன் சேர்த்து 95 ° C. வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்கள் கொதிக்க வைப்பதன் மூலம் பிணைக்கப்பட்ட புரதங்கள் நீக்கப்பட்டன.கட்டுப்பாட்டு சுமை உள்ளீடு மற்றும் மணிகள் செறிவூட்டப்பட்ட மாதிரிகள் SDS-PAGE ஆல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு நிலையான வெஸ்டர்ன் பிளட் முறைகள் மூலம் PVDF சவ்வுகளுக்கு (மில்லிபோர், #ISEQ00010) மாற்றப்பட்டன.0.1% ட்வீன்-20 (TBST) கொண்ட TBS இல் 5% ஸ்கிம் மில்க் (Sangon, #A600669) மூலம் சவ்வுகள் தடுக்கப்பட்டு முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளுடன் வரிசையாக அடைகாத்தன.முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் TBST இல் 5% கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பாலில் 1:1000 நீர்த்தப்பட்டு ஒரே இரவில் 4°C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டது.இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள் 1:5000 என்ற விகிதத்தில் பயன்படுத்தப்பட்டு அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் அடைகாக்கப்பட்டது.கெமிடாக் எம்பி இமேஜிங் முறையைப் பயன்படுத்தி கெமிலுமினென்சென்ஸ் மூலம் சவ்வுகள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.படத்தில் உள்ள கறைகள் மற்றும் ஜெல்களின் வெட்டப்படாத அனைத்து ஸ்கேன்களும் மூல தரவுகளாக வழங்கப்படுகின்றன.
இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்பட்ட முதன்மை ஆன்டிபாடிகளில் முயல் எதிர்ப்பு SFPQ மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (CST, எண். 71992), முயல் எதிர்ப்பு FUS மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (CST, எண். 67840), முயல் எதிர்ப்பு NSUN2 பாலிகுளோனல் ஆன்டிபாடி (புரோடீன்டெக், எண். 20854-1-1-1- AP), முயல் எதிர்ப்பு mSin3A பாலிகுளோனல் ஆன்டிபாடி (Abcam, #ab3479), மவுஸ் ஆன்டி-டேக் மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (TransGen, #HT201-02), மவுஸ் ஆன்டி-β-ஆக்டின் மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (டிரான்ஸ்ஜென், #HC201-01), முயல் எதிர்ப்பு -CDK2 மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (ABclonal, #A0094), முயல் மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிக்கு CTBP1 (ABclonal, #A11600), DUT க்கு முயல் பாலிக்குளோனல் ஆன்டிபாடி (ABclonal, #A2901), PSMC4 க்கு முயல் பாலிக்குளோனல் ஆன்டிபாடி (ABclonal, #Arabbit), #A25 DNAJB1 பாலிகுளோனல் ஆன்டிபாடி (ABclonal, # A5504).இந்த ஆன்டிபாடிகள் டிபிஎஸ்டியில் 5% கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பாலில் 1:1000 நீர்த்தத்தில் பயன்படுத்தப்பட்டது.இந்த ஆய்வில் பயன்படுத்தப்பட்ட இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளில் 1:5000 நீர்த்தத்தில் முயல் எதிர்ப்பு IgG (TransGen, #HS101-01), எதிர்ப்பு சுட்டி IgG (TransGen, #HS201-01) ஆகியவை அடங்கும்.
BRD4 SFPQ உடன் தொடர்பு கொள்கிறதா என்பதை மேலும் ஆராய, நிலையான HEK293T மற்றும் BRD4-miniSOG செல்கள் HEK293T ஐ மிகைப்படுத்தி 10 செமீ உணவுகளில் பூசப்பட்டன.செல்கள் குளிர்ந்த பிபிஎஸ் மூலம் கழுவப்பட்டு, 1 மில்லி பியர்ஸ் ஐபி லிசிஸ் பஃப்பரில் (தெர்மோ ஃபிஷர், #87787) EDTA இல்லாத புரோட்டீஸ் தடுப்பானுடன் 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 30 நிமிடங்களுக்கு லைஸ் செய்யப்பட்டன.அதன் பிறகு, லைசேட்டுகள் 1.5 மில்லி மையவிலக்கு குழாய்களில் சேகரிக்கப்பட்டு, 15,871 xg இல் 10 நிமிடங்களுக்கு 4 ° C இல் மையவிலக்கு செய்யப்பட்டது.சூப்பர்நேட்டண்ட் அறுவடை செய்யப்பட்டு 5 µg ஆன்டி-வி5 லேபிளிடப்பட்ட மவுஸ் மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (CST, #80076) உடன் ஒரே இரவில் 4 ° C வெப்பநிலையில் அடைகாக்கப்பட்டது.சுமார் 50 µl புரத A/G காந்த மணிகளை (MCE, #HY-K0202) 0.5% Tween-20 கொண்ட PBS உடன் இரண்டு முறை கழுவவும்.பின்னர் செல் லைசேட்டுகள் காந்த மணிகளால் 4 மணி நேரம் 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் கீழிருந்து மேல் சுழற்சியுடன் அடைக்கப்பட்டுள்ளன.பின்னர் மணிகள் 1 மில்லி பிபிஎஸ்டி பஃபருடன் நான்கு முறை கழுவப்பட்டு 95 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் 5 நிமிடம் வேகவைக்கப்பட்டது.SDS-PAGE ஜெல்களில் மாதிரிகள் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டு நிலையான வெஸ்டர்ன் பிளட் முறைகளைப் பயன்படுத்தி PVDF சவ்வுகளுக்கு மாற்றப்பட்டன.டிபிஎஸ்டியில் 5% நீக்கப்பட்ட பாலில் சவ்வுகள் தடுக்கப்பட்டு முதன்மை மற்றும் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளுடன் தொடர்ச்சியாக அடைகாத்தன.முதன்மை ஆன்டிபாடி ராபிட் எதிர்ப்பு SFPQ மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடி (CST, #71992) TBST இல் 5% கொழுப்பு நீக்கப்பட்ட பாலில் 1:1000 என்ற விகிதத்தில் பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் ஒரே இரவில் 4 ° C இல் அடைகாக்கப்பட்டது.முயல் எதிர்ப்பு IgG 1:5000 என்ற விகிதத்தில் பயன்படுத்தப்பட்டது மற்றும் அறை வெப்பநிலையில் 1 மணிநேரம் அடைகாக்கப்பட்டது.கெமிடாக் எம்பி இமேஜிங் முறையைப் பயன்படுத்தி கெமிலுமினென்சென்ஸ் மூலம் சவ்வுகள் காட்சிப்படுத்தப்பட்டன.
கரைப்பான் அணுகக்கூடிய மேற்பரப்புப் பகுதி (SASA) பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படும் அனைத்து கட்டமைப்புகளும் புரத தரவு வங்கி (PDB) 52 அல்லது ஆல்பாஃபோல்ட் புரோட்டீன் கட்டமைப்பு தரவுத்தளத்திலிருந்து பெறப்பட்டது.FreeSASA நிரலைப் பயன்படுத்தி ஒவ்வொரு எச்சத்திற்கும் முழுமையான SASA கணக்கிடப்பட்டது.பெயரிடப்பட்ட ஹிஸ்டைடின் மற்றும் அதன் அண்டை நாடுகளுக்கான முழுமையான மற்றும் தெளிவற்ற SASA தரவு மட்டுமே ஒவ்வொரு கட்டமைப்பிற்கும் சராசரி SASA ஐப் பெற பயன்படுத்தப்பட்டது.ஒவ்வொரு ஹிஸ்டைடினுக்கும் தொடர்புடைய கரைப்பான் அணுகல்தன்மை (RSA) முழுமையான SASA மதிப்பை கரைப்பானுக்குக் கிடைக்கும் அனுபவ அதிகபட்ச சாத்தியமான எச்ச மேற்பரப்புப் பகுதியால் வகுப்பதன் மூலம் கணக்கிடப்பட்டது.அனைத்து ஹிஸ்டைடின்களும் பின்னர் சராசரி RSA 20% க்கும் குறைவாக இருந்தால் மறைக்கப்பட்டதாக வகைப்படுத்தப்படும், இல்லையெனில் வெளிப்படும்56.
DDA முறையில் பெறப்பட்ட மூலக் கோப்புகள், பொதுவான அசுத்தங்களைக் கொண்ட பொருத்தமான SwissProt சரிபார்க்கப்பட்ட புரதத் தரவுத்தளத்தில் Proteome Discoverer (v2.5) அல்லது MSfragger (Fragpipe v15.0) ஐப் பயன்படுத்தி தேடப்பட்டன.பெப்டைட்களுக்கு இரண்டு விடுபட்ட பிளவு தளங்களுடன் முழுமையான டிரிப்சின் தேவைப்படுகிறது, கார்பமாயில் மெத்திலேஷன் ஒரு நிலையான மாற்றமாகவும், மெத்தியோனைன் ஆக்சிஜனேற்றம் மாறும் மாற்றமாகவும் இருந்தது.முன்னோடி மற்றும் துண்டு எடை சகிப்புத்தன்மை முறையே 10 ppm மற்றும் 0.02 Da (MS2 ஆர்பிட்ராப்) என அமைக்கப்பட்டது. அசுத்தமான வெற்றிகள் அகற்றப்பட்டன, மேலும் <1% தவறான கண்டுபிடிப்பு விகிதத்தைப் பெற புரதங்கள் வடிகட்டப்பட்டன. அசுத்தமான வெற்றிகள் அகற்றப்பட்டன, மேலும் <1% தவறான கண்டுபிடிப்பு விகிதத்தைப் பெற புரதங்கள் வடிகட்டப்பட்டன. Попаdaniya zagryaznyayusich veschestv были udalenы, а பெல்கி ஆட்ஃபில்ட்ரோவனி, டெக். அசுத்தமான தாக்கங்கள் அகற்றப்பட்டு, <1% தவறான கண்டறிதல் விகிதத்தைக் கொடுக்க புரதங்கள் வடிகட்டப்பட்டன.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попаdaniya загрязняющих веществ бли удалены, அ பெல்கி ஆடியில்ட்ரோவனி <%டோஸ்ட்டிஷெனியா உரோவ்னியா11 தவறான நேர்மறை விகிதத்தை <1% அடைய மாசுபடுத்தும் வெற்றிகள் அகற்றப்பட்டு புரதங்கள் வடிகட்டப்பட்டன.லேபிள்களைப் பயன்படுத்தாமல் அளவு பகுப்பாய்விற்கு, மூன்று உயிரியல் மறுநிகழ்வுகளிலிருந்து இயல்பாக்கப்பட்ட புரத உள்ளடக்கம் பயன்படுத்தப்பட்டது.DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 மற்றும் Alice Ting குழுவால் தொகுக்கப்பட்டு வெளியிடப்பட்ட தரவுத்தளங்களிலிருந்து ஜீன் ஆன்டாலஜி (GO) பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி புரோட்டீன் துணை செல்லுலார் உள்ளூர்மயமாக்கல் பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.எரிமலை வரைபடம் பெர்சியஸிடமிருந்து பெறப்பட்டது (v1.6.15.0). இரண்டு பக்க டி-டெஸ்ட்டைப் பயன்படுத்தி புள்ளியியல் முக்கியத்துவத்திற்காக புரோட்டீன் மிகுதியான மடிப்பு மாற்றங்கள் சோதிக்கப்பட்டன, மேலும் புரோட்டீன் வெற்றிகள் மிகுதியான மாற்றம்>2 (வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால்) மற்றும் p மதிப்பு <0.05 உடன் அடையாளம் காணப்பட்டன. இரண்டு பக்க டி-டெஸ்ட்டைப் பயன்படுத்தி புள்ளியியல் முக்கியத்துவத்திற்காக புரோட்டீன் மிகுதியான மடிப்பு மாற்றங்கள் சோதிக்கப்பட்டன, மேலும் புரோட்டீன் வெற்றிகள் மிகுதியான மாற்றம்>2 (வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால்) மற்றும் p மதிப்பு <0.05 உடன் அடையாளம் காணப்பட்டன. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. புள்ளியியல் முக்கியத்துவத்திற்காக புரத உள்ளடக்க மடிப்பு மாற்றங்கள் இரண்டு வால்கள் கொண்ட டி-டெஸ்டைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டன, மேலும் புரதப் பொருத்தங்கள் உள்ளடக்க மாற்றம் >2 (குறிப்பிடப்படாத வரை) மற்றும் ap மதிப்பு <0.05 உடன் அடையாளம் காணப்பட்டன.双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 变化 的 显着性 ， 确定 蛋白质 中 的 变化 变化 变化 变化 变化 变化 除非 除非 有 说明 和 p 值 <0.05使用 t 检验 测试 蛋白质 数 变化 的 统计 并 确定 蛋白质 的 丰度 变化> 2 （另 说明 和 和 p 值 <0.05 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. புரத உள்ளடக்கத்தில் மடிப்பு மாற்றங்களின் புள்ளியியல் முக்கியத்துவம் இரண்டு-வால்கள் கொண்ட டி-டெஸ்ட்டைப் பயன்படுத்தி சோதிக்கப்பட்டது, மேலும் உள்ளடக்க மாற்றங்கள் > 2 (குறிப்பிடப்படாவிட்டால்) மற்றும் p- மதிப்புகள் <0.05 ஆகியவற்றிற்கு புரதப் பொருத்தங்கள் தீர்மானிக்கப்பட்டன.சரம் தரவுத்தளத்துடன் GO பகுப்பாய்வைப் பயன்படுத்தி புரத தொடர்பு பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது.
இதேபோன்ற முடிவுகளுடன் மூன்று உயிரியல் பிரதிகள் மேற்கொள்ளப்பட்டன.கிராப்பேட் ப்ரிஸம் (கிராப்பேட் மென்பொருள்) மூலம் புள்ளிவிவர பகுப்பாய்வு செய்யப்பட்டது மற்றும் பெர்சியஸ் (v1.6.15.0) மூலம் எரிமலை அடுக்குகள் உருவாக்கப்பட்டன.இரண்டு குழுக்களையும் ஒப்பிட்டுப் பார்க்க, இரண்டு வால் கொண்ட மாணவர்களின் டி-டெஸ்ட்டைப் பயன்படுத்தி p-மதிப்புகள் தீர்மானிக்கப்பட்டது.சோதனைக் குழுவில் குறைந்தது இரண்டு முறை அடையாளம் காணப்பட்ட சிங்கிள்டன் புரதங்கள் மட்டுமே எரிமலை அடுக்குகளில் சேர்க்கப்பட்டுள்ளன, மேலும் கட்டுப்பாட்டு குழுவில் தொடர்புடைய காணாமல் போன மதிப்புகள் சாதாரண விநியோகத்திலிருந்து பெர்சியஸால் மாற்றப்பட்டன, இதனால் p- மதிப்பைக் கணக்கிட முடியும்.பிழை பார்கள் சராசரி ± நிலையான விலகலைக் குறிக்கின்றன.புள்ளியியல் பகுப்பாய்விற்கான புரோட்டியோமிக் பகுப்பாய்வுகளில், குறைந்தது இரண்டு உயிரியல் பிரதிகளில் தோன்றிய புரதங்களின் மிகுதியாகத் தக்கவைக்கப்பட்டது.மாதிரி அளவை முன்கூட்டியே தீர்மானிக்க புள்ளிவிவர முறைகள் பயன்படுத்தப்படவில்லை.சோதனைகள் சீரற்றவை அல்ல.சோதனை மற்றும் முடிவுகளின் மதிப்பீட்டின் போது ஆராய்ச்சியாளர்கள் பணிகளுக்கு கண்மூடித்தனமாக இருக்கவில்லை.
ஆய்வு வடிவமைப்பு பற்றிய கூடுதல் தகவலுக்கு, இந்தக் கட்டுரையுடன் இணைக்கப்பட்டுள்ள இயற்கை ஆராய்ச்சி அறிக்கையின் சுருக்கத்தைப் பார்க்கவும்.
இந்த ஆய்வில் பெறப்பட்ட மாஸ் ஸ்பெக்ட்ரோமெட்ரி தரவு, தரவுத்தொகுப்பு ID PXD034811 (PDPL-MS தரவுத்தொகுப்பு) இன் கீழ் iProX57 கூட்டாளர் களஞ்சியத்தின் மூலம் ProteomeXchange கூட்டமைப்புக்கு சமர்ப்பிக்கப்பட்டது.மூல தரவு மூல தரவு கோப்புகளின் வடிவத்தில் வழங்கப்படுகிறது.இந்த கட்டுரை அசல் தரவை வழங்குகிறது.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. அக்கம் பக்கத்தை அறிந்து கொள்வது: புரோட்டீன் வளாகங்கள் மற்றும் வரைபட உறுப்புகளை வகைப்படுத்துவதற்கு அருகாமை சார்ந்த பயோடைனிலேஷனைப் பயன்படுத்துதல். Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. அக்கம் பக்கத்தை அறிந்து கொள்வது: புரோட்டீன் வளாகங்கள் மற்றும் வரைபட உறுப்புகளை வகைப்படுத்துவதற்கு அருகாமை சார்ந்த பயோடைனிலேஷனைப் பயன்படுத்துதல்.Gingras, AS, Abe, KT மற்றும் Raut, B. சுற்றுப்புறங்களுடன் பரிச்சயம்: புரோட்டீன் வளாகங்கள் மற்றும் வரைபட உறுப்புகளை வகைப்படுத்துவதற்கு அருகாமை சார்ந்த பயோடைனிலேஷனைப் பயன்படுத்துதல். Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. அக்கம் பக்கத்தைப் புரிந்துகொள்வது: உயிரியல் வாழ்வில் அக்கம் பக்கத்தின் சார்பைப் பயன்படுத்துங்கள்.Gingras, AS, Abe, KT மற்றும் Raut, B. அருகாமையைப் புரிந்துகொள்வது: புரோட்டீன் வளாகங்களின் குணாதிசயம் மற்றும் அருகாமை சார்ந்த பயோடைனிலேஷனைப் பயன்படுத்தி உறுப்புகளின் மேப்பிங்.தற்போதைய.என் கருத்து.இரசாயனம்.உயிரியல் 48, 44–54 (2019).
ஜெரி, ஜேபி மற்றும் பலர்.டெக்ஸ்டர் ஆற்றலை நோயெதிர்ப்பு உயிரணுக்களுக்கு மாற்றுவதன் மூலம் நுண்ணிய சூழலை வரைபடமாக்குதல்.அறிவியல் 367, 1091–1097 (2020).
ஹெர்ட்லிங், EL மற்றும் பலர்.இரண்டு-புரோட்டீம் அளவிலான நெட்வொர்க்குகள் மனித ஊடாடலின் செல்-குறிப்பிட்ட மறுவடிவமைப்பைக் கண்டறிகின்றன.கலங்கள் 184, 3022–3040.e3028 (2021).
இடுகை நேரம்: செப்-15-2022
